瘦素在病理性瘢痕中的表達及臨床意義

向小燕，蔡燕，周國富，黃佳佳

(1.川北醫學院附屬醫院燒傷整形科;2.川北醫學院附屬醫院檢驗科，四川 南充 637000)

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是一種皮膚纖維化疾病。病理性瘢痕的存在，嚴重地影響著患者的身體健康及生命質量。對瘢痕的防治，一直是目前創傷修復研究的熱點問題。瘦素(leptin)是由肥胖基因所編碼的含有167個氨基酸殘基的分泌性蛋白質，作為一種特殊的致纖維化因子參與了眾多組織增生、肥大及纖維化［1－6］。leptin參與了皮膚創傷修復過程［7－9］，它能刺激成纖維細胞(FB)的增殖和合成膠原。leptin是否在病理性瘢痕這一纖維化疾病的發生方面也起到類似的作用呢?目前國內外學者尚無相關的報道。本實驗期望通過檢測增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中leptin的表達情況，研究leptin與病理性瘢痕發生的關系，拓展病理性瘢痕在細胞因子致病機理方面的研究，期望為今后的瘢痕防治提供一條新的線索。

1 資料與方法

1.1 臨床病例及資料收集

收集川北醫學院附屬醫院燒傷科2010年1月至2010年6月間增生性瘢痕10例，瘢痕疙瘩10例，正常皮膚10例。所有瘢痕標本均取自患者要求進行瘢痕整復手術時所切除的增生性瘢痕，瘢痕疙瘩組織標本，正常皮膚來自包皮環切手術中切除的丟棄的皮膚組織或者植皮手術中供皮區多余的皮膚。所有瘢痕病程均在12～24個月。所有患者均無合并皮膚疾病，結締組織疾病和其它重要臟器的疾病，未使用類固醇激素，青霉胺和抗腫瘤藥物，均未經過化療，放療，激光治療及免疫治療。標本均經病理證實。每例標本切下后15 min內冰下采集，置入－70℃冰箱保存。

表1 受試者一般臨床資料(n=10±s)

表1 受試者一般臨床資料(n=10±s)

正常對照組5/5 18±2 －增生性瘢痕組 6/4 25±4 18±5瘢痕疙瘩組3/7 22±7 17±8

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 PCR儀、凝膠成像儀(美國BIO-RAD)、Trzol總 RNA提取試劑盒(美國 Invitrogen公司)，MMLV逆轉錄酶為Fermentas RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(印度Fermenta biotech LTD)，PCR聚合酶(北京天根生化科技有限公司)。

1.2.2 引物設計與合成 根據Genebank中的Leptin基因編碼序列(序列號NM_000230.2)，用在線引物設計軟件Primer3設計引物，并交上海生工生物工程有限合成。Leptin引物:FP:5'-CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG-3'，RP:5'-TTGATGGCTGAAGACCTTGG-3'，產物長度為 250bp。

1.2.3 聚合酶鏈反應(PCR)Trizol試劑盒提取各組織中的總RNA，測定其濃度和純度后，各取約1 μg用MMLV逆轉錄酶逆轉錄為cDNA備用。定量PCR擴增Leptin，同時擴增GAPDH作內參，反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，51℃退火延伸30 s，以每一標本的平均拷貝數與相應內參平均拷貝數的比值進行統計學分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS12.0軟件包，組間比較采用單因素方差分析，并進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統有學意義。

2 結果

正常皮膚，增生性瘢痕，瘢痕疙瘩組織中瘦素mRNA的相對表達情況:瘦素mRNA表達在250 bp處出現一條亮帶。電泳結果顯示10例正常皮膚呈現低表達，表達量為0.55±0.17;增生性瘢痕組織有高表達，表達量為0.86±0.13;瘢痕疙瘩組織呈現超高表達，表達量為 1.32±0.15。Leptin mRNA的表達量在增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組都明顯高于正常皮膚組(P＜0.01)，在瘢痕疙瘩組又明顯高于增生性瘢痕組(P＜0.01)。(圖1，表2)

圖1 Leptin PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

表2 Leptin在各組間表達情況(±s)

表2 Leptin在各組間表達情況(±s)

正常對照組10 0.55 ±0.17增生性瘢痕組 10 0.86 ±0.13*瘢痕疙瘩組 10 1.32 ±0.15*

3 討論

瘦素(leptin)是由肥胖(ob)基因所編碼的含有167個氨基酸殘基的分泌性蛋白質，主要由白色脂肪產生，是一種具有多樣性功能的活性因子。leptin與器官纖維化的發生關系密切:(1)能夠誘血管平滑肌及心肌成纖維細胞的增生肥大［4－5］;(2)Leptin能促肝纖維化的發生、發展，并且是肝纖維化過程中必不可少的因素［1，10－11］;(3)Leptin 也參與腎纖維化發生、發展過程［12－14］;(4)瘦素還能促進矽肺組織纖維化和氣道纖維化形成［3，6］;(5)瘦素參與了胰腺纖維化［2］。leptin的致纖維化作用可能主要是通過調節 TGF-β1 等細胞因子的表達而實現［15－17］。學者們［18－20］通過抑制或沉默leptin的表達，能夠成功阻抑肝纖維化。Leptin有望成為纖維化疾病基因治療的新靶點。

Leptin還參與了創傷修復過程，因為研究發現:皮膚創面滲出物中leptin水平增高［7］，并且leptin受體表達上調［8］，受體表達越強則上皮增殖越快［9］，外源性leptin能顯著促進創傷愈合［21－22］。成纖維細胞(fibroblast，FB)是主要的創傷修復細胞，FB含所有類型的leptin受體，并且能合成和分泌leptin;外源性leptin能夠促進體外培養FB增殖和膠原合成［23］。上述表明，在創傷修復過程，FB能分泌leptin，同時又作為leptin作用的靶細胞之一，介導了leptin促進創面愈合的過程。瘢痕是皮膚組織創傷修復后的必然產物。病理性瘢痕是由于全身和局部因素的影響，發生異常的損傷修復過程，是創傷過度修復的結果。組織學上以成纖維細胞(FB)的過度增生和細胞外基質(ECM)的過度聚集為特征，是一種真皮纖維化疾病。病理性瘢痕包括增生性瘢痕或瘢痕疙瘩。瘢痕疙瘩較增生性瘢痕而言，其膠原合成代謝功能失去正常的約束控制，持續處于亢進狀態，以致其膠原纖維增生的程度高于增生性瘢痕。考慮到leptin參與皮膚創面修復過程，結合到leptin能致器官纖維化這一點，我們不禁想到，和致其它器官纖維化一樣，leptin在病理性瘢痕這一皮膚創傷過度修復過程中是否也發生了相同的促進作用呢?leptin是否可能也作用于病理性瘢痕的成纖維細胞，導致其過度增殖和細胞外基質的過度沉積?

本研究的結果顯示，在病理性瘢痕中存在leptin的高表達，而在瘢痕疙瘩中的表達比在增生性瘢痕中的表達尤高，Leptin的表達程度與瘢痕纖維化程度一致。結果顯示leptin參與到了病理性瘢痕的形成過程中。但具體機制需要進一步研究證實。

通過本研究，使瘦素致器官纖維化作用的研究進一步擴展，對病理性瘢痕發病機制中細胞因子方面的研究進一步深入。如果進一步深入研究其致病機理以期進行藥物干預，這也為延緩病理性瘢痕發生的進程提供了一條新的思路，為病理性瘢痕的治療提供新的理論支持，這將可能為病理性瘢痕患者帶來新的希望。

［1］Piche T，Vandenbos F，Abakar-Mahamat，et al.The severity of liver fibrosis is associated with high leptin levels in chronic hepatitis C［J］.Viral Hepatol，2004，11(1):91 －96.

［2］鄒芳芳，陳少夫，鄭宏.瘦素及瘦素受體在大鼠胰腺纖維化組織中表達的變化［J］.中華胰腺病雜志，2010，10(3):210－211.

［3］裴厚霜，李永斌，范德龍，等.瘦素對矽肺大鼠肺組織纖維化的影響及與HIF-1a的相關性分析［J］.細胞與分子免疫學雜志，2014，30(7):700 －703.

［4］Schram K，De Girolamo S，Madani S，et al.Leptin regulates MMP-2，TIMP-1 and collagen synthesis via p38-MAPK in HL-1 murine cardiomyocytes［J］.Cell Mol Biol Lett，2010，15(4):551 － 563.

［5］Fukui A，Takahashi N，Nakada C，et al.Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation［J］.Circ ctrrhythin Electrophysiol，2013，6(2):402 －409.

［6］周瑞娟，朱述陽，陶洪臣，等.瘦素對大鼠氣道平滑肌細胞TGFβ1及I型膠原蛋白表達的影響［J］.細胞與分子免疫學雜志，2013，29(10):1047 －1049.

［7］Marikovsky M，Ro senblum CI，Faltin Z，et al.Appearance of leptin in wound fluid as a response to injury［J］.Wound Repair Regen，2002，10(5):302 －307.

［8］Stallmeyer B，Kampfer H，Podda M，et al.A novel keratinocyte mitogen:regulation of leptin and its functional receptor in skin repair［J］.Invest Dermatol，2001，117(1):98 － 105.

［9］Murad A，Nath AK，Cha ST，et al.Leptin is an autocrine/paracrine regulator of wound healing［J］.FASEB J，2003，17(13):1895－1897.

［10］Garcia-Suarez C，Crespo J，Fernandez-Gil PL，et al.Plasma leptin levels in patients with primary biliary cirrhosis and their relationship with degree of fibrosis［J］.Gastroenterol Hepatol，2004，27(2):47－50.

［11］Honda H，Ikejima K，Hirose M，et al.Leptin is required for fibrogenic responses induced by thioacetamide in the murine liver［J］.Hepatology，2002，36(1):12 －21.

［12］郭曉晶，王利華.大鼠腎小管間質纖維化過程中血清瘦素水平的變化［J］.山西醫科大學學報，2007，38(8):698 －700.

［13］Wolf G，Hamann A，Han DC，et al.Leptin stimulates proliferation and TGF-β expression in renal glomerular endotehelial cells:potential role in glomerulosclerosis［J］.Kidney Int，1999，56:860.

［14］Han DC，Isono M，Chen S，et al.Leptin stimulates type I collagen production in db/db mesangial cells:glucose up take and TGF-beta typeⅡ receptor expression［J］.Kidney Int，2001，59(4):1315 －1323.

［15］Ikejima K，Takei Y，Honda H，et al.Leptin receptor mediated signaling regulates hepatic fibrogenesis and remodeling of extracellular matrix in the rat［J］.Gastroenterology，2002，122(5):1399 －1410.

［16］楊利才，張道友，朱新儉，等.5/6腎切除大鼠血清瘦素水平變化及其與腎小球硬化關系［J］.放射免疫學雜志，2006，19(2):87－90.

［17］李浩，李俊，黃成，等.瘦素及轉化生長因子β1與四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型逆轉恢復的相關性研究［J］.中國藥理學通報，2011，27(4):473 －477.

［18］Xue X，Lin J，Song Y.RNA interference targeting leptin gene effect on hepatic stellate cells［J］.Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2005，25(6):655 －657.

［19］薛秀蘭，邢玉剛，吳曉鷺，等.小干擾RNA沉默瘦素揭示了瘦素在大鼠纖維化中的作用［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2014，23(3):270 －274.

［20］Zhai X，Yan K，Fan J，et al.The b-calenin pathway contributes to the effects of leptin on SREBP-1c expression in rat hepalic stellate cells and liver fibrosis［J］.Br J Pharmaco，2013，169(1):197 －212.

［21］文輝才，巫國輝，陳雯，等.局部應用瘦素對大鼠燙傷創面愈合的實驗研究［J］.南方醫科大學學報，2012，32(5):703 －706.

［22］李培兵，金宏，劉佃辛，等.瘦素促進皮膚創傷大鼠膠原合成的實驗研究［J］.中國應用生理學雜志，2011，27(1):72 －74.

［23］李培兵，金宏，劉佃辛，等.瘦素對體外大鼠成纖維細胞增殖與膠原合成的影響［J］.中國修復重建外科雜志，2005，19(1):20－22.