逍遙散對慢性束縛應激所致肝郁脾虛證大鼠饑餓素的影響

金鐘曄，王少賢，白明華，李娜，景玉霞，3，劉群，陳家旭*

（1.北京中醫藥大學基礎醫學院，北京100029；2.河北醫科大學中醫學院，石家莊050051；3.新疆醫科大學中醫學院，烏魯木齊830054）

逍遙散對慢性束縛應激所致肝郁脾虛證大鼠饑餓素的影響

金鐘曄1，王少賢2，白明華1，李娜1，景玉霞1，3，劉群1，陳家旭1*

（1.北京中醫藥大學基礎醫學院，北京100029；2.河北醫科大學中醫學院，石家莊050051；3.新疆醫科大學中醫學院，烏魯木齊830054）

目的觀察逍遙散對慢性束縛應激所致肝郁脾虛證大鼠饑餓素（Ghrelin）的影響，探討逍遙散的作用機制。方法24只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、逍遙散組，每組8只；正常組不進行任何處理，模型組和逍遙散組通過連續21 d慢性束縛應激建立肝郁脾虛證候模型，逍遙散組于每天上午束縛前灌服逍遙散混懸液3.854 g／kg，正常組和模型組灌服生理鹽水2 mL。比較各組大鼠的一般情況、飲水量及攝食量、體質量變化情況，用ELISA方法測定大鼠血漿及胃底部組織中Ghrelin的濃度。結果束縛21 d后，模型組大鼠體質量、攝食量、飲水量較正常組降低，增加減緩。與模型組相比，逍遙散組體質量、攝食量、飲水量均增加，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。模型組的血漿及胃底部Ghrelin含量比正常組低（P＜0.05），而逍遙散組的胃底部Ghrelin含量比模型組高（P＜0.05），與正常組相近；模型組的血漿Ghrelin含量低于逍遙散組（P＜0.01）。結論肝郁脾虛證模型大鼠血漿及胃底部組織中Ghrelin含量下降，逍遙散能提高Ghrelin水平，對肝郁脾虛證有明顯調節作用，對Ghrelin的調節作用可能是逍遙散治療肝郁脾虛證的可能機制之一。

慢性束縛應激；肝郁脾虛；逍遙散；饑餓素

饑餓素（Ghrelin）是KOJIMA等［1］于1999年首先應用免疫組化的方法發現在人和小鼠的下丘腦弓狀核的核心處和胃內的分泌細胞有一種含28個氨基酸殘基的多肽。Ghrelin能刺激釋放生長激素，同時透過食欲的促進，使脂肪增加而升高體質量［2］。它廣泛分布于多種組織器官，其中胃底泌酸腺的頸部和基部組織中濃度最高，占全身的20%左右，血液循環中70%的Ghrelin也是由胃底分泌的［3］。Ghrelin對調節攝食活動具有舉足輕重的作用。研究表明，正常人體皮下注射Ghrelin往往引起饑餓反應，食物攝入量明顯增加［4］。為了明確逍遙散對肝郁脾虛證調節機制，本實驗采用21 d慢性束縛應激方法建立肝郁脾虛模型并進行評價；采用ELISA方法對胃底部及血漿中Ghrelin含量進行觀察，分析肝郁脾虛證Ghrelin的變化及逍遙散的調節機制。

1 實驗材料

1.1 動物與分組健康雄性SD大鼠24只，體質量180～200 g，清潔級，由北京維通利華實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK（京）2006-0009。實驗動物提前購入，飼養于清潔級動物房，大鼠適應喂養1周后，按體質量隨機分為正常組8只，不予束縛，灌服生理鹽水；模型組8只，束縛21 d，灌服生理鹽水；逍遙散組8只，束縛21 d，灌服逍遙散。動物每籠8只群養，室溫（25±1）℃，相對濕度50%～60%，光照明暗各12 h（明7：00-19：00，暗19：00-次日7：00），喂常規飼料和飲用水。

1.2 中藥及制備實驗用藥復方選用《太平惠民和劑局方》的逍遙散（北柴胡30 g，當歸30 g，白芍30 g，白術30 g，茯苓15 g，炙甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g），由北京同仁堂（亳州）飲片有限責任公司提供，根據《北京市中藥炮制規范》，按原書配伍比例由中日友好醫院中藥制劑室煎煮、濃縮成藥粉備用。用時根據需要量用蒸餾水配制成一定濃度的溶液。

1.3 主要儀器大鼠束縛架和代謝籠由動物室提供。高速冷凍離心機，日立公司。超低溫冰箱Forma-86℃，Thermo USA。自動電熱壓力蒸汽滅菌器ZDX-35BI，上海申安醫療器械廠。Ghrelin ELISA試劑盒，美國R＆D公司（由北京康源瑞得生物技術有限公司檢測，檢測儀器：Multiskan Mk3全自動酶標儀，Thermo Fisher Scientific公司）。

2 實驗方法

2.1 模型制備及藥物干預以慢性束縛方式制備大鼠模型［5］，將模型組和逍遙散組2組大鼠，束縛于特制的束縛架上（T型束縛臺：底座寬10 cm、長20 cm、厚2.8 cm，上端束縛臺長22 cm，最寬處6.6 cm，前端有固定頭部的小架和適合四肢放置的凹槽，上端束縛臺有兩條可調的軟帶，分別在胸、腹部固定），每天3 h，束縛時間點隨機，每次開始造模前30 min各組大鼠灌胃，逍遙散組灌服逍遙散混懸液［用藥量3.854 g／（kg·d），按成人平均體質量70 kg／d用藥量換算］。正常組和模型組灌服生理鹽水2 mL。

2.2 體質量、攝食量、飲水量實驗1、2、3周早上8：00，束縛前用電子稱進行體質量、飲用水、飼料的稱量。

2.3 取材及指標檢測方法實驗第22天，按0.4 g／100 g給藥量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取血2 mL于事先加入抗凝劑的試管中，4℃3 000 r／min離心10 min，分離血漿，抽取上清液，分別裝至凍存管內，標記編號后-70℃保存，以備檢測。解剖大鼠腹腔，取出胃，剪開胃大彎，用生理鹽水涮洗2次至干凈，濾紙吸干，剪取胃底部組織約100 mg，加入1 mL生理鹽水制作10%勻漿，于4℃3 000 r／min離心30 min，取上清液于-70℃冰箱中保存備用。依照試劑盒說明書，用ELISA法檢測大鼠胃底部和血漿中Ghrelin水平變化。

2.4 統計分析方法計量資料采用均數±標準差（ˉx±s）表示，運用SPSS 17.0軟件，對一般數據作正態分布和組間方差齊性檢驗。兩項均符合，應用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行統計學處理，采用LSD法作組間比較，以P＜0.05作為差異存在統計學意義的界限。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠攝食量變化第1周，模型組和逍遙散組攝食量與正常組相比都有減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。第2周，各組與第1周相比進食量基本沒有變化。模型組與正常組相比有顯著下降（P＜0.05），逍遙散組與模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。第3周，正常組與第2周相比攝食量幾乎無變化，模型組攝食量有減少，但逍遙散組的攝食量增加。3組之間比較發現模型組和正常組差異有統計學意義（P＜0.01），逍遙散組和模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），逍遙散組與正常組攝食量接近，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠攝食量變化情況（ˉx±s，n＝8）g

3.2 各組大鼠體質量變化第1周，模型組和正常組比較差異有統計學意義（P＜0.01），逍遙散組和正常組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。第2周，模型組和正常組相比差異有統計學意義（P＜0.01），逍遙散組和模型組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。第3周，模型組和正常組相比差異仍然有統計學意義（P＜0.01），逍遙散組和模型組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠體質量變化情況（ˉx±s，n＝8）g

3.3 各組大鼠飲水量變化造模第1周，模型組大鼠飲水量明顯少于正常組（P＜0.01）。第2、3周，模型組大鼠飲水量較正常組有減少趨勢，但差異無統計學意義，逍遙散組飲水量與正常組比較差異無統計學意義。見表3。

表3 各組大鼠飲水量變化情況（ˉx±s，n＝8）g

3.4 慢性束縛應激后各組大鼠胃底部和血漿Ghrelin含量的變化模型組胃底部Ghrelin含量，與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；逍遙散組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

模型組血漿Ghrelin含量，與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；逍遙散組與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表4。

表4 胃底部和血漿Ghrelin含量的變化分析（ˉx±s，n＝8）

4 討論

中醫經典《靈樞》里的“司外揣內，司內揣外”是指通過觀察事物外在表象，以揣測分析其內在狀況和變化的一種思維方法。應激是動物受到各種因素強烈刺激時，所出現的一連串神經內分泌反應，以及由此所引起的機體的各種變化［5］。對于適當的應激，哺乳動物可以透過行為及內分泌方面的變化來維持內環境穩定狀態，但慢性應激可能引起各種程度的心理或者身體障礙，引起臟腑失調、氣血紊亂產生疾病，屬于肝郁脾虛的范疇［6］。中醫肝病的證候跟神經-內分泌-免疫系統的功能紊亂有密切關系［7］。逍遙散是治療肝郁脾虛證的經方，許多實驗已證明逍遙散對機體神經-內分泌-免疫系統的調節作用。以慢性束縛應激方法制作的肝郁脾虛證大鼠模型，可通過進食量、飲水量、體質量的變化判斷模型的成功與穩定性［8］。正常組大鼠在整個實驗過程當中與實驗前基本一致，精神良好、活動度好、皮毛潔白潤澤無脫落、眼角無異物、糞便麥粒形且干稀適中。逍遙散組大鼠動作靈敏、毛發潤澤整潔，逍遙散組較模型組好，起到穩定的效應，表明逍遙散有很好的干預調節作用。

實驗中，模型組隨著造模的進行，逐步適應，束縛時大鼠表現為體質量增加緩慢，攝食量、飲水量有少于正常組的趨勢。第2、3周，模型組明顯出現攝食量減少。逍遙散組第1、2周與模型組類似，但由于藥物作用，大鼠狀況較模型組好。第3周，逍遙散組與正常組接近，與模型組比較有明顯的差別。該結果與本課題組前期研究一致［9］。逍遙散組在整個實驗過程中，體質量、攝食量、飲水量都高于模型組，逍遙散起到穩定的效應，表明逍遙散有很好的干預調節作用，證明慢性束縛應激方法建立肝郁脾虛大鼠模型成功。

Ghrelin主要由胃合成，通過原位雜交方法表明，Ghrelin的mRNA主要存在于胃底泌酸腺頸部和底部［1］。Ghrelin具有刺激垂體千葉釋放生長激素（GH）、增加食欲、調節能量代謝平衡以及促進胃酸分泌等生物學功能［10］。Ghrelin對攝食和體質量調節的作用，長期應用會增加進食量，體質量增加［11］。大鼠在禁食、低血糖和注射瘦素（Leptin）時，胃內Ghrelin的表達上調，這說明Ghrelin在攝食活動中起到了重要的調節作用。有研究表明Ghrelin對大鼠的攝食量和胃酸分泌有促進作用［12］；正常人皮下注射Ghrelin會引起饑餓反應，食物攝入量明顯增加［4］。

實驗結果表明模型組的血漿Ghrelin濃度明顯低于正常組和逍遙散組，與預測一致，經逍遙散治療后可以升高血漿中的Ghrelin濃度，說明逍遙散能夠調節Ghrelin的濃度。模型組胃底部的Ghrelin水平與正常組相比有顯著性差異，逍遙散組與模型組之間也存在著明顯的差異。由此可知，逍遙散能有效地行干預調節作用，調整組織中Ghrelin的濃度，進而有效地調整胃功能及增強食欲。綜合分析實驗大鼠的體質量、攝食量、飲水量結果，Ghrelin與體質量、攝食量、飲水量的關系為正比率關系，所以實驗結果也與各家的眾多研究一致［13-14］。實驗結果表明逍遙散對消化和代謝功能也有很好的干預調節作用。這可能是逍遙散治療肝郁脾虛證的作用機制之一。而具體的調節機制仍有許多可深入研究的部分。

逍遙散是疏肝解郁的名方，是針對肝郁脾虛血弱患者而設。慢性束縛應激是肝郁日久，木郁乘土，肝郁脾虛，氣血紊亂而出現病理變化。逍遙散對肝郁脾虛證具有很好的調節作用。實驗［15］證明逍遙散能夠有效地提升肝郁脾虛證大鼠的脾胃功能，這種調節作用應該是經由多種通路和機制調控。本研究提示Ghrelin與慢性抑郁可能存在必然聯系，并驗證了逍遙散對Ghrelin的調節作用。本研究僅就有限的條件做一表淺的研究，但為進一步深入研究逍遙散對Ghrelin調節機制提供了實驗依據。

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Xiao Yao San on Ghrelin levels in rats with liver depression and spleen deficiency syndrome indeced by immobilization stress

JIN Zhongye1，WANG Shaoxian2，BAI Minghua1，LI Na1，JING Yuxia1，3，LIU Qun1，CHEN Jiaxu1*
（1.School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2.College of Chinese Medicine，Hebei Medicine University，Hebei 050051，China；3.College of Chinese Medicine，Xinjiang Medicine University，Urumchi 830054，China）

ObjectiveThis experiment was designed to measure the effect of Xiao Yao San on treating liver depression and spleen deficiency syndrome by recording the changes of Ghrelin levels in the blood and the stomach bottom of fundic glands in chronic immobilization stress（CIS）model rats.MethodsThe 24 male SD rats were randomly divided into 3 groups（8 rats for each group）：normal group，model group and Xiao Yao San group.We didn’t make any deal with normal group，but model and Xiao Yao San groups by continuous 21 day immobilization stress cause induced liver depression and spleen deficiency syndrome，before every morning bondage administered Xiao Yao San（3.854 g／Kg·d）to the Xiao Yao San group and administered a saline liquid（2 mL）to the normal and model groups.We used ELISA to measure the Ghrelin levels inboth the blood and stomach bottom after death on day 22.ResultAfter 21 days，the model group rat body weight，food intake，water quantity increase slower than normal group.The Xiao Yao San group increase faster than model group，they have a statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.The model group showed a significant decrease in the Ghrelin level contents in both the blood and stomach bottom compared to the Xiao Yao San and the normal groups（P＜0.05），but the Xiao Yao San group had a higher level of Ghrelin in stomach bottom than model group（P＜0.05）.Normal groups had similar Ghrelin level contents in stomach bottom；The model group had a lower level of Ghrelin in the blood than Xiao Yao San group（P＜0.01）.ConclusionXiao Yao San can effectively treat rats with immobilization stress induced liver depression and spleen deficiency condition by raising the levels of Ghrelin in both the blood and stomach bottom.

chronic immobilization stress；liver depression and spleen deficiency；Xiao Yao San；Ghrelin

R256

A

1003-5699（2015）09-0934-04

：張瑞彬

2014-11-17）

10.13463／j.cnki.jlzyy.2015.09.021

國家自然科學基金項目（30672578）；國家杰出青年科學基金課題（30825046）。

金鐘曄（1974-），男，韓國籍，博士研究生，主要從事中醫證候的病理生理基礎研究。

*通信作者：陳家旭，電話-（010）64286656，電子信箱-chenjx＠bucm.edu.cn