麻角定喘消痰湯對小兒哮喘發作外周血中Toll樣受體表達的影響

佟雪飛,郭海軍

(邢臺市人民醫院 中醫科，河北 邢臺 054000)

?

麻角定喘消痰湯對小兒哮喘發作外周血中Toll樣受體表達的影響

佟雪飛,郭海軍

(邢臺市人民醫院 中醫科，河北 邢臺 054000)

目的 探討麻角定喘消痰湯對哮喘發作患兒外周血中Toll樣受體1(Toll-like receptors，TLR1)、TLR2、TLR4表達的影響及可能機制。方法 選擇2012年1月～2014年6月期間80例哮喘發作患兒為研究對象。將80例哮喘患兒按照隨機數字表法隨機分為觀察組和對照組各40例。觀察組：40例，給予麻角定喘消痰湯治療；對照組：40例，給予常規治療。檢測受試者治療前和治療后TLR1、TLR2、TLR4、IL-6、TNF-α的表達情況。結果 與治療前比較，治療后觀察組和對照組中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞中TLR1、TLR2的表達增強(P<0.05)，觀察組TLR1、TLR2的表達強度高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療前和治療后對照組TLR4的表達無顯著差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組TLR4的表達顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)；治療前和治療后，對照組患兒外周血中IL-6、TNF-α的表達無顯著差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組IL-6、TNF-α的表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.01)。結論 麻角定喘消痰湯可提高機體免疫調節能力，抑制患兒氣道炎性反應和氣道高反應性，最終控制哮喘的發作及進展。

支氣管哮喘；急性發作；麻角定喘消痰湯；Toll樣受體；機制

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒呼吸科常見的呼吸系統疾病[1]，多種細胞因子和炎性因子在哮喘發病過程中起介導作用[2]。外周血中中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞等細胞在受到外界刺激后，可通過分泌細胞因子，引起Th1/Th2免疫應答失衡，使機體免疫反應方向偏向Th2，進而導致哮喘的發病及哮喘病情的加重[3]。Toll樣受體1(Toll-like receptors，TLR1)、TLR2、TLR4是TLRs中的重要成員，可由上述外周血細胞產生[4]。研究[5-7]顯示，哮喘患者外周血中TLRs存在異常表達，而TLRs的異常表達參與了哮喘的發病。本研究采用麻角定喘消痰湯治療哮喘發作患兒，并重點檢測了治療前、治療后哮喘發作患兒外周血中中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞等細胞中TLR1、TLR2、TLR4的表達情況，旨在探討麻角定喘消痰湯對哮喘發作患兒外周血中TLR1、TLR2、TLR4表達的影響及可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月～2014年6月期間被本院收治的80例哮喘發作患兒為研究對象，患兒年齡在3～15歲，上述患兒均符合哮喘的診斷標準[1]。將80例哮喘患兒按照隨機數字表法隨機分為觀察組和對照組各40例。觀察組：40例，平均年齡(6.2±4.1)歲，男22例，女18例，平均病程(24.7±3.5)個月。對照組：40例，平均年齡(4.8±2.7)歲，男24例，女16例，平均病程(24.2±3.1)個月。觀察組和對照組在年齡、性別、病程方面比較，差異無統計學意義。本研究均獲患兒監護人知情并簽署知情同意書，同時獲本院倫理委員會審核批準。

1.2 納入排除標準 納入標準[1]：年齡3～15歲；哮喘急性發作患兒，符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》的診斷標準；支氣管舒張劑治療有效。排除標準[1]：近1個月內呼吸道感染者；免疫系統疾病者；血液系統疾病者；嚴重肝腎疾病者；嚴重心腦血管疾病者；結核感染者；排除哮喘外的呼吸系統其他疾病。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組：適量運動，注意休息，避免過度勞累，保持良好情緒，避免接觸過敏原，防寒保暖，避免微生物感染，觀察28 d。

1.3.2 觀察組：麻角定喘消痰湯組方：蘇子(10 g)，地龍(10 g)，前胡(10 g)，麻黃(5 g)，丹參(10 g)，浙貝母(10 g)，百部(10 g)，白前(10 g)，大皂角(10 g)，苦杏仁(5 g)，桑白皮(10 g)，枇杷葉(10 g)。袋/劑，1劑/1～2日，溫開水沖服，1天3次，4天/療程。

1.4 TLR1、TLR2、TLR4表達的檢測 入院時取受試者靜脈血3 mL，肝素抗凝，使用流式細胞儀全血雙色免疫熒光直標法檢測，每例受試者取抗凝全血300 μL，分裝3管，每管均加10 mg/L抗異硫氰酸熒光素單抗。2管實驗管分別加抗10 mg/L TLR1-PE、TLR2-PE、TLR4-PE，1管對照管加10 mg/L同型對照IgG2a，避光孵育30 min，抗體購自上海華大基因科技公司，采用CyTOF質譜流式細胞儀(上海華大基因科技公司)獲取中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞，數據分析使用FCS Express 5軟件。采用同型對照校正非特異染色檢測TLR1、TLR2、TLR4的表達情況，以細胞的TLR相對平均熒光強度表示，TLR相對平均熒光強度=TLR平均熒光強度/同型對照平均熒光強度。

1.5 IL-6、TNF-α的檢測 于清晨空腹狀態下抽取受試者外周靜脈血3 mL，3500 r/min離心10 min，上清液-80 ℃保存待測。采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α等指標，試劑盒購自于上海華大基因，嚴格按照說明書進行操作。

2 結果

2.1 觀察組和對照組外周血中性粒細胞TLR1、TLR2、TLR4的表達 治療前觀察組和對照組中性粒細胞TLR1、TLR2的表達無統計學差異，與治療前比較，治療后觀察組和對照組中性粒細胞TLR1、TLR2的表達增強(P<0.05)，觀察組TLR1、TLR2的表達強度高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療前和治療后對照組TLR4的表達無顯著差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組TLR4的表達顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 觀察組和對照組外周血中性粒細胞TLR1、TLR2、TLR4的表達情況Tab.1 Expression of peripheral blood neutrophils TLR1, TLR2 and TLR4 in observation group and control group ±s)

*P<0.05，與治療前相比，compared with before treatment；#P<0.05，與同期對照組相比，compared with control group

2.2 觀察組和對照組外周血肥大細胞TLR1、TLR2、TLR4的表達 治療前觀察組和對照組肥大細胞TLR1、TLR2、TLR4的表達無統計學差異，與治療前比較，治療后觀察組和對照組肥大細胞TLR1、TLR2的表達增強(P<0.05)，觀察組TLR1、TLR2的表達強度高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療前和治療后對照組TLR4的表達無統計學差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組TLR4的表達顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 觀察組和對照組外周血肥大細胞中TLR1、TLR2、TLR4的表達情況Tab.2 Expression of peripheral blood mast cells TLR1, TLR2 and TLR4 in observation group and control group ±s)

*P<0.05，與治療前相比，compared with before treatment；#P<0.05，與同期對照組相比，compared with control group

2.3 觀察組和對照組外周血巨噬細胞TLR1、TLR2、TLR4的表達 治療前觀察組和對照組中性粒細胞TLR1、TLR2、TLR4的表達無統計學差異，與治療前比較，治療后觀察組和對照組巨噬細胞TLR1、TLR2的表達增強(P<0.05)，觀察組TLR1、TLR2的表達強度高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；治療前和治療后對照組TLR4的表達無統計學差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組TLR4的表達顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 觀察組和對照組外周血巨噬細胞中TLR1、TLR2、TLR4的表達情況Tab.3 The expression of peripheral blood macrophages cells TLR1, TLR2 and TLR4 in observation group and control group ±s)

*P<0.05，與治療前相比，compared with before treatment；#P<0.05，與同期對照組相比，compared with control group

2.4 觀察組和對照組治療前、治療后外周血中IL-6、TNF-α的表達 治療前和治療后，對照組患兒外周血中IL-6、TNF-α的表達無統計學差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組IL-6、TNF-α的表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 觀察組和對照組治療前、治療后外周血中IL-6、TNF-α水平比較±s)Tab.4 The levels of peripheral blood IL-6, TNF-α in observation group and control group before and after ±s)

*P<0.05，與治療前相比，compared with before treatment；#P<0.05，與同期對照組相比，compared with control group

2.5 不良反應 治療后，2組患兒隨訪期間均未出現明顯的不良反應。

3 討論

本研究采用麻角定喘消痰湯治療哮喘急性發作患兒，并重點探討了麻角定喘消痰湯對哮喘發作患兒外周血中TLR1、TLR2、TLR4表達的影響及可能機制。本研究檢測結果顯示，哮喘發作患兒在接受麻角定喘消痰湯治療后，外周血中中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞等細胞中TLR1、TLR2、TLR4等TLRs成員的表達均出現顯著變化，TLR1、TLR2的水平出現顯著上升，TLR4的表達則出現明顯下調；而對照組治療后TLR1、TLR2的表達雖較治療前上調，但幅度小于麻角定喘消痰湯組，且對照組治療前和治療后TLR4的表達并無顯著變化。另一方面，隨訪期間我們發現，哮喘患兒接受麻角定喘消痰湯治療后未出現明顯的不良反應。表明麻角定喘消痰湯對哮喘發作患兒外周血中TLR1、TLR2、TLR4的表達有顯著影響，且安全性高。其可促進TLR1、TLR2的分泌，抑制TLR4的表達，進而轉變Th1/Th2免疫應答的方向，使機體免疫反應方向偏向Th1，繼而提高機體免疫調節功能，抑制哮喘急性發作患兒氣道炎性反應，降低機體氣道高反應性，有效控制哮喘患兒哮喘的發作及進展。

Kumar等[8]研究發現，哮喘急性發作患者外周血中TLR4的表達顯著高于哮喘緩解期患兒及健康兒童，且TLR4可通過調節IL-6、TNF-α等促炎因子的表達參與哮喘的發作。表明外周血中的TLR4的異常表達與哮喘的病情進展密切相關[9-10]，但國內的相關研究較少。本研究在麻角定喘消痰湯治療前和治療后分別檢測了哮喘發作患兒外周血中IL-6、TNF-α等指標的表達情況，檢測結果顯示，哮喘急性發作患兒外周血中IL-6、TNF-α等指標的檢測含量較治療前明顯下降，而對照組患兒治療前和治療后IL-6、TNF-α的表達并無顯著變化，這與Satumino等[11]的研究結果接近。Satumino等在研究中采用TLR4阻斷劑抑制TLR4的表達，并檢測TLR4阻斷前和阻斷后外周血單核巨噬細胞中IL-6、TNF-α等指標的表達，檢測結果顯示，在給予TLR4阻斷劑后外周血單核巨噬細胞中IL-6、TNF-α等指標表達明顯較給予阻斷劑之前下調，而給予TLR2阻斷劑前后IL-6、TNF-α等指標的表達并無顯著改變。表明TLR4可能是通過調控IL-6、TNF-α的表達進而參與哮喘發作的。TLR4可增強IL-6、TNF-α等指標的表達，進而導致哮喘急性發作，而TLR2可能并不直接調控IL-6、TNF-α的表達。TLR4調控IL-6、TNF-α等促炎因子表達的可能機制有：TLR4是脂多糖的受體，機體體內TLR4與脂多糖結合時，可招募TNF受體相關因子及系列接頭蛋白，隨后在磷酸化的作用下，誘導部分轉錄因子入胞，進而促進IL-6、TNF-α等促炎細胞因子的表達，導致哮喘急性發作[12-15]。本研究結果表明，麻角定喘消痰湯治療哮喘急性發作的另一個可能機制是，通過下調TLR4的表達，抑制IL-6、TNF-α等重要促炎細胞因子的表達，進而減輕哮喘發作患兒氣道的炎癥水平，抑制患兒氣道高反應性，最終控制哮喘的急性發作[16]。

本研究不足之處是入組對象較少、規模較小，另一方面未進一步探討TLR1、TLR2等指標的可能作用機制，因此后期仍然需要更大規模的研究進一步驗證。本研究顯示，麻角定喘消痰湯對哮喘發作患兒外周血中TLR1、TLR2、TLR4的表達有顯著影響，其可促進TLR1、TLR2的表達，抑制TLR4、IL-6及TNF-α的表達，提高機體免疫調節能力，抑制患兒氣道炎性反應和氣道高反應性，最終控制哮喘的發作及進展。但相關機制仍然需要進一步深入研究。

[1] 中華醫學會兒科學會呼吸學組,《中華兒科雜志》編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J].中華兒科雜志,2008,46(10):745-753.

[2] 李艷,黃克武,孫英，等.肥大細胞Toll樣受體在支氣管哮喘中的作用研究進展[J].國際呼吸雜志,2013,33(23):1797-1800.

[3] 韋江紅,莫碧文,陶贊英，等.地塞米松對支氣管哮喘大鼠氣道重塑及氣道平滑肌中Toll樣受體4表達的影響[J].中華結核和呼吸雜志,2011,34(3):212-213.

[4] Arshi M,Cardinal J,Hill RJ,et al.Asthma and insulin resistance in children[J].Respirology,2010, 5(5):779-784.

[5] 李艷,黃克武,孫英，等.肥大細胞Toll樣受體在支氣管哮喘中的作用研究進展[J].中華哮喘雜志(電子版),2013,7(6):443-447.

[6] 祁聰聰,劉春濤.Toll樣受體在支氣管哮喘和其他過敏性疾病中的作用[J].中華哮喘雜志(電子版),2012,6(3):212-217.

[7] Theoharides TC,Alysandratos KD.AngelidouA,et al.Mast cell and inflammation[J].Biochim Biophys Acta,2012,1822 (1): 21-33.

[8] Kumar V, Sharma A.Mast cell: emerging sentinel innate immune cells with diverse role in immunity[J].Mol Immunol, 2010, 48 (1-3): 14-25.

[9] 潘明鳴,孫鐵英,張洪勝，等.慢性持續期支氣管哮喘患者外周血中性粒細胞和單核細胞Toll樣受體的表達及意義[J].中華哮喘雜志(電子版),2012,6(1):21-25.

[10] 朱海星,湯葳,時國朝，等.Toll樣受體4與支氣管哮喘氣道高反應[J].中華哮喘雜志(電子版),2011,5(5):358-361.

[11] Satumino SF, Prado RO, Cunha-Melo JR, et al.Endotoxin tolerance and cross-tolerance in mast cells involves TLR4,TLR2 and FcepsilonRl interactions and SOCS expression: perspectives on immunomodulation in infectious and allergic diseases[J].BMC Infect Dis,2010,10(5):240.

[12] Nabe T.Tumor Necrosis Factor Alpha-Mediated Asthma[J].Int Arch Allergy Immunol,2012,160(2):111-113.

[13] 汪鳳鳳,苗偉偉,李紅巖，等.Toll樣受體4介導的Th2免疫在支氣管哮喘中的作用[J].中華哮喘雜志(電子版),2011,5(5):353-357.

[14] Mahajan SG, Mehta AA.Suppression of ovalbumin-induced Th2-driven airway inflammation by 13-sitosterol in a guinea pig model of asthma[J].Eur J Pharmacol, 2011, 650(1):458-464.

[15] Knight-Madden J,Vergani D,Patey R, et a1.Cytokine levels and profiles in children related to sickle cell disease and asthma status[J]．J Interferon Cytokine Res,2012,32(1):1-5.

[16] Choi JP,Kim YS,Kim OY,et al.TNF-alpha is a key mediator in the development of Th2 cell response to inhaled allergens induced by a viral PAMP double-stranded RNA[J].Allergy,2012,67(9):1138-1148.

(編校：譚玲)

Influence of Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction on Toll-like receptors expression in peripheral blood of pediatric asthma

TONG Xue-fei,GUO Hai-jun

(Department of Traditional Chinese Medicine, Xingtai People’s Hospital, Xingtai 054000, China)

ObjectiveTo study influence of Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction on TLR1, TLR2, TLR4 expression changes in peripheral blood of pediatric asthma and its possible mechanism.MethodsFrom January 2012 to June 2014, 80 cases of children with asthma were selected as the research object.80 cases of children with asthma according to random number table method were randomly divided into observation group and control group(n=40).Observation group: 40 cases were given Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction; control group: 40 cases were given routine therapy.Expression of TLR1, TLR2 and TLR4, IL-16, TNF-α before and after treatment were tested.ResultsExpression of TLR1, TLR2 enhanced after treatment in neutrophils, mast cells, macrophages, compared with before treatmen(P<0.05).Expression of TLR1, TLR2 were higher than those of control group, and the difference was statistically significant (P< 0.05).Expression of TLR4 in control group before and after treatment had no significant difference.Expression of TLR4 was significantly lower after treatment, compared with before treatment and at the same time in control group, and the difference was statistically significant (P<0.05).Expression of IL-6, TNF-α in control group in peripheral blood in children before and after treatment had no significant difference, but expression of IL-6, TNF-α in observation group were significantly lowered after treatment, compared with before treatment and the same period in control group, and the difference was statistically significant (P<0.01). ConclusionMa Kok Dingchuan Phlegm Decoction could improve immune adjustment ability, inhibit airway inflammatory reaction and improve reactivity of children, and ultimately control the onset and progress of asthma.

bronchial asthma; acute attack; Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction; Toll-like receptors; mechanism

佟雪飛，女，本科，主治醫師，研究方向：中醫，E-mail：conglitong@163.com。

R259

A

1005-1678(2015)02-0130-04