內質網應激反應觸發肝硬化大鼠模型肝細胞凋亡及纖維化機制的探討

蔣天鵬,王黎洲,李興,宋杰,吳曉萍,周石

(貴陽醫學院附屬醫院 放射科，貴州 貴陽 550004)

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內質網應激反應觸發肝硬化大鼠模型肝細胞凋亡及纖維化機制的探討

蔣天鵬,王黎洲,李興,宋杰,吳曉萍,周石Δ

(貴陽醫學院附屬醫院 放射科，貴州 貴陽 550004)

目的 用動物實驗的方法，探討研究在肝硬化組織中形成肝纖維化的特殊機制。方法 將60只Wistar大鼠隨機平均分為3組：肝硬化組(n=20)、假注射組(n=20)、對照組(n=20)；在肝硬化組大鼠腹腔內注射二甲基亞硝胺建立肝硬化模型。大鼠肝組織經HE染色后觀察肝纖維化及肝硬化，使用Western blot檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和結蛋白(desmin)的表達，使用流式細胞儀檢測早期及晚期凋亡。內質網應激(ER stress)相關的未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)通道蛋白和凋亡蛋白(CHOP和caspase-12)均進行Western blot檢測和/或 RT-PCR檢測。結果 肝硬化組均成功建立肝硬化大鼠模型，并發現在肝硬化大鼠模型中出現了更多的肝纖維化。流式細胞學檢測顯示，在肝硬化模型中出現的早期和晚期細胞凋亡顯著高于對照組(P<0.05)。肌醇激酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)在肝硬化鼠模型中的表達均顯著升高(P<0.05)。內質網應激蛋白(CHOP)在肝硬化大鼠模型中的表達與對照組比較也顯著升高(P<0.05)。結論 在肝硬化大鼠模型的肝組織中可發現明顯的細胞凋亡，這種細胞凋亡是通過激活內質網應激介導的IRE1和CHOP蛋白引起的。

肝硬化；細胞凋亡；內質網應激；肌醇激酶1；CHOP蛋白

肝硬化通常因肝炎病毒感染或酗酒對肝造成的長期破壞所致，其特點是肝內廣泛纖維化和肝功能異常[1]。長期、晚期肝硬化通常不可逆，并常與靜脈曲張出血或肝細胞肝癌的發生有關。因此，肝硬化是導致全球發病率和死亡率升高的主要疾病[2]。在肝組織中，休眠的肝星型細胞(hepatic stellate cells，HSC)和肝成纖維細胞是肝細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主要組成部分，而這2種細胞在肝硬化發病中起關鍵作用[3-4]。盡管HSC和成纖維細胞的增殖、遷移是肝纖維化的致病原因，但近期研究[5-6]顯示，肝細胞凋亡也可能參與了肝纖維化和肝硬化的形成。

近年多項研究顯示，內質網應激反應在誘導和調節細胞凋亡中起到了關鍵作用[7-8]，內質網應激反應與多種通道有關，如內質網相關蛋白降解和未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)[9]。UPR通道也可激活數種蛋白，包括肌醇激酶1(inositol requiring enzyme-1，IRE1)、PKR樣ER蛋白激酶(PKR-like ER kinase，PERK)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)[10]，上述蛋白質可進一步激活細胞凋亡。本實驗旨在研究和探討肝硬化大鼠模型中肝纖維化的特殊發病機制，為尋求肝硬化患者治療方法提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 大鼠肝硬化模型建立 選用4～6周齡的Wistar大鼠(貴陽醫學院實驗動物中心，許可證號：SYXK(黔)2012-0001)60只，雌雄不限，體質量0.18～0.2 kg。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。本研究實驗組為40只大鼠，其中注射組20只、假注射組20只；剩余20只在處死前未接受注射的正常大鼠作為對照組。使用溶于生理鹽水的二甲基亞硝胺(日本國東京化成工業會社，LOTMA1041)對注射組大鼠進行了腹腔內注射，劑量為10 mg/kg，每周連續給藥3天，持續5周；嚴格按照金樹根等[11]的方法建立肝硬化模型及肝硬化判斷標準參照其標準。同時，假注射組大鼠腹腔內僅注射與二甲基亞硝胺劑量相等的生理鹽水。

1.2 組織學檢查 10周后，所有動物全部處死并取肝組織行組織學檢查。組織學檢查由1名經驗豐富且對本實驗內容不知情的病理醫師完成。肝組織使用10%福爾馬林或70%乙醇溶液固定，并使用石蠟包埋。在結蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的免疫組化檢查中，組織切片分別與單克隆抗鼠α-SMA抗體(圣克魯茲生物技術公司，圣克魯茲，美國)和單克隆抗鼠結蛋白抗體(圣克魯茲生物技術公司，圣克魯茲，美國)反應1 h。免疫組化操作程序按照Xu K等的報道[12]。

1.3 HE染色 將上述石蠟包埋肝組織切片，使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)和天狼星紅染色以評定肝硬化。組織切片的分類根據Goldani等[13]的報道。

1.4 Western blot分析 使用Western blot分析來檢測α-SMA和結蛋白(desmin)的表達，在緩沖液樣品中將細胞裂解進行SDS-PAGE檢測。蛋白質被電印到聚偏二氟乙烯膜上。在使用含有5%脫脂牛奶的PBS阻斷后，將膜用兔抗大鼠單克隆或多克隆抗體培養(所有抗體均購自美國圣克魯茲)。免疫反應性蛋白用增強的化學發光試劑顯影。

2 結果

2.1 在肝硬化大鼠模型中纖維化加重 本研究肝硬化組所有小鼠均能存活10周以上。正常肝、肝纖維化和肝硬化的組織學圖片見(圖1A)。肝組織被裂解并進行Western blot分析。結果表明，肝硬化組與假注射組、對照組相比α-SMA和結蛋白在肝臟的表達均有升高(P<0.05)(圖1B)。這些發現明確提示肝硬化組20只小鼠均成功建模。

圖1 肝纖維化在3組中的形成情況A：接受二甲基亞硝胺腹腔注射的大鼠肝臟切片的鏡下圖片(箭頭提示陽性細胞，HE，×200)；B：Western blot檢測分析α-SMA和結蛋白(desmin)在肝硬化組、假注射組和對照組大鼠肝臟中的表達*P<0.05，與假手術組比較；#P<0.05，與對照組比較Fig.1 Fibrosis formation in the cirrhotic group, sham group and control groupA:photomicrographs of liver sections stained from the rats receiving dimethylnitrosamine intraperitoneally (the positive staining cells represented by arrows, HE,×200); B:changes in expression of hepatic α-SMA and desmin in cirrhotic group, sham group and control group

2.2 肝硬化大鼠的肝細胞凋亡分析 流式細胞學檢測表明，在肝硬化模型中，早期凋亡細胞率、晚期凋亡細胞率顯著高于假注射組和對照組(P<0.01)，死亡細胞率顯著高于假注射組和對照組(P<0.05，見圖2)。

圖2 肝硬化模型中大鼠的肝細胞凋亡結果A：3組大鼠膜聯蛋白V/PI雙染檢測(X軸表示經PI染色的細胞數目，Y軸表示膜聯蛋白V-FITC染色細胞的數量)；B：統計分析[膜聯蛋白V標記的細胞(Q1區域)百分比]*P<0.05，**P<0.01，與假手術組比較；#P<0.05，##P<0.01，與對照組比較Fig.2 Apoptosis results in the cirrhosis modelA:Annexin V/PI double staining assays of cells in three groups(X axis indicates the number of PI stained cells; Y axis indicates the number of Annexin VFITC stained cells);B:statistical analysis[the percentages of the cells labeled with only Annexin V (counted in Q1 region)]**P<0.01，*P<0.05，compared with sham group；##P<0.01，#P<0.05，compared with control group

2.3 內質網應激UPR通道參與肝硬化介導的細胞凋亡 在本研究中，內質網應激UPR的3個主要因素，包括IRE1，PERK和ATF6，通過Western blot法(圖3)和RT-PCR分析(圖4)分別進行了分析。結果顯示，與假注射組和對照組比較，注射組IRE1的表達顯著增加(圖3A，P<0.05)。此外，上述UPR蛋白的mRNA表達用半定量RT-PCR分析，如圖4所示，假注射組和對照組IRE1的mRNA水平較注射組升高(圖4A，P<0.01)。3組中ATF6和p-PERK沒有顯著差異(見圖4B、C)。

圖3 內質網應激UPR通道蛋白檢測*P<0.05，與假手術組比較；#P<0.05，與對照組比較Fig.3 Examination of unfolded protein response pathway proteins*P<0.05，compared with sham group；#P<0.05，compared with control group

圖4 內質網應激UPR相關基因的mRNA水平檢測A：IRE1的mRNA；B：裂解ATF6的mRNA；C：p-PerK的mRNA**P<0.01，與假手術組比較；##P<0.01，與對照組比較Fig.4 Examination of mRNA levels of ER stress associated UPR genes**P<0.01， compared with sham group；##P<0.01，compared with control group

2.4 肝硬化大鼠中CHOP在介導內質網應激相關凋亡中的作用分析 探討在肝組織中導致細胞凋亡的具體途徑，對經裂解的半胱氨酸蛋白酶12和CHOP蛋白的細胞水平使用Western blot檢測法進行了評價。結果顯示，與對照組相比，CHOP蛋白含量水平在肝硬化組中顯著升高(P<0.05)。與假注射組和對照組比較，裂解的半胱氨酸蛋白酶12在肝硬化模型中無顯著差異(圖5)。

圖5 細胞凋亡相關蛋白表達*P<0.05，與假手術組比較；#P<0.05，與對照組比較Fig.5 Apoptosisrelated protein expression*P<0.05，compared with sham group； #P<0.05，compared with control group

3 討論

因肝外傷和/或炎癥的影響，激活態的肝星形細胞和成纖維細胞使外基質沉積在肝臟中，是肝硬化和肝纖維化形成過程中的主要來源。另一方面，在肝纖維化自我修復過程中，活化的肝星形細胞和成纖維細胞可激發細胞凋亡[14]。因此，肝細胞和成纖維細胞密切參與了肝纖維化/肝硬化的修復過程。雖然有探索肝硬化和細胞凋亡關系的研究[15-16]，但本課題是最先研究肝組織中導致肝硬化具體機制的課題之一。

肝纖維化的形成可在肝硬化大鼠模型中被觀測到。結果表明，與正常對照組相比，肝纖維化在肝硬化模型中表現顯著。現在所知的肝纖維化直至肝硬化的形成過程中，需要細胞進行纖維化相關蛋白的表達。因此，本研究檢測了肝組織中的α-SMA和結蛋白[17]。顯著增加的纖維組織擴張、α-SMA和結蛋白在肝內表達提示肝纖維化和肝硬化的形成。我們推測，肝細胞凋亡時有一種潛在機制導致α-SMA和結蛋白的強化表達。

為了探討肝硬化與凋亡相關的具體機制，對內質網應激(UPR通路)相關蛋白，包括p-PERK，IRE1，ATF6水平進行了檢測[18]。本研究發現IRE1蛋白和mRNA在肝硬化模型的肝組織中均被激活。所以IRE1 UPR通路可能參與了肝硬化相關凋亡的過程，肝硬化相關凋亡可能有助于進一步闡明纖維化在肝纖維化或肝硬化發展中的作用。既往研究表明，IRE1活化可激活內質網相關的細胞凋亡和細胞死亡[19]。這些數據有力證明了內質網應激出現在肝硬化大鼠模型中。因此本研究推測，內質網應激可能參與了肝纖維化、肝硬化形成的病理過程。

根據已發表的文獻[20]，內質網應激相關因子(裂解的半胱氨酸蛋白酶-12和CHOP蛋白)可被檢測用以確定參與肝硬化發病機制中的特定細胞凋亡因子。一些學者發現，裂解的半胱氨酸蛋白酶-12可以激活半胱氨酸蛋白酶-3和觸發細胞凋亡，同時CHOP可以直接誘導內質網應激相關的細胞凋亡[21-22]。在本研究中，我們發現裂解的半胱氨酸蛋白酶12蛋白(激活態)在所有分組中均無顯著差異。然而，注射組大鼠的CHOP水平顯著高于假注射組和對照組。從這些結果我們發現，內質網應激相關的CHOP蛋白被激活，從而誘導細胞凋亡進入下一步。因此，我們研究發現內質網應激誘導活化的CHOP可導致纖維化發生。

總之，細胞凋亡可在肝硬化大鼠的肝組織中被發現，而細胞凋亡是通過激活內質網應激介導的IRE1和CHOP蛋白引起的。

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(編校：王儼儼，譚玲)

Mechanism of liver cell apoptosis and fibrosis triggered by ER stress in liver cirrhosis rat model

JIANG Tian-peng,WANG Li-zhou,LI Xing,SONG Jie,WU Xiao-ping,ZHOU ShiΔ

(Department of Radiology, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China)

ObjectiveTo investigate specific mechanism of the forming of fibrosis or cirrhosis in hepatic cirrhosis tissues.Methods60 Wistar rats were randomly divided into three groups equally: cirrhotic group (n=20), sham group(n=20) and control group(n=20); The cirrhosis model was established by intraperitoneally administered dimethylnitrosamine.The HE staining was performed on the hepatic tissues of the rats to observe the fibrosis or cirrhosis.Western blot was employed to detect the α-smooth muscle actin(α-SMA) and desmin protein expression.Flow cytometry analysis was used to examine the early and late apoptosis.The ER stress associated unfolded protein response (UPR) pathway proteins and the apoptotic proteins (CHOP and caspase-12) were also detected by Western blot and/or RT-PCR.ResultsThe cirrosis model was established successfully in cirrhotic group and more fibrosis was formed in the cirrhosis rat model.Flow cytometry analysis showed that early and late apoptosis in cirrhosis model were significantly higher compared with control group (P<0.05).The expression of UPR pathway protein and inositol requiring enzyme 1(IRE1) were increased significantly in the cirrhosis rat tissues(P<0.05).The expression of CHOP protein in cirrhosis model was significantly increased compared with the control group (P<0.05). ConclusionThe obvious apoptosis is observed in the hepatic tissue of cirrhosis rats, and the apoptosis was caused by activating the ER stress mediated IRE1 and CHOP protein.

liver cirrhosis; apoptosis; ER stress; IRE1; CHOP protein

貴州省科技廳社會發展基金(黔科合SY字【2012】3145號)

蔣天鵬，男，碩士，副主任醫師，研究方向：外周介入的治療與臨床研究，E -mail：wlz_wlz@163.com；周石，通信作者，學士，男，主任醫師，研究方向：外周及神經介入的治療與臨床研究，E-mail：156722229@qq.com。

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1005-1678(2015)02-0092-04