脂氧素在對乙酰氨基酚所致急性肝損傷中的保護作用及機制研究

李世清,杜宗漢,周曉晴,羅君,安啟嫻,靳斌

(1.川北醫學院第二臨床學院，南充市中心醫院 消化內科，四川 南充 637000；2.云南省第二人民醫院 消化內科，云南 昆明 650032；3.山東大學 臨床醫學系，山東 濟南 250100)

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脂氧素在對乙酰氨基酚所致急性肝損傷中的保護作用及機制研究

李世清1,杜宗漢1,周曉晴1,羅君1,安啟嫻2,靳斌3

(1.川北醫學院第二臨床學院，南充市中心醫院 消化內科，四川 南充 637000；2.云南省第二人民醫院 消化內科，云南 昆明 650032；3.山東大學 臨床醫學系，山東 濟南 250100)

目的 探討脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)在對乙酰氨基酚所致肝損傷中的保護作用及可能機制。方法 100只雄性新西蘭大白兔隨機分為空白對照組、對乙酰氨基酚組(PCM組)、N-乙酰半胱胺酸組(NAC組)和脂氧素A4組(LXA4組)4組，每組25只。除空白組兔外給其他3組兔對乙酰氨基酚灌胃24 h后NAC組靜脈注射NAC，LXA4組靜脈注射LXA4，36 h后，麻醉動物取肝臟組織進行免疫組化及RT-PCR分析并檢測肝組織中TNF-α和IL-10的表達，Western blot檢測NF-κB p65的表達。結果 PCM組NF-κB p65的表達水平明顯高于空白對照組(P<0.01)，NAC、LXA4治療組NF-κB p65的表達顯著低于PCM組且具有統計學意義(P<0.01)。對乙酰氨基酚組肝臟組織中TNF-α mRNA水平高于脂氧素A4組和空白對照組(P<0.05)。脂氧素A4組中IL-10 mRNA表達水平明顯高于對乙酰氨基酚組(P<0.05)。結論 脂氧素A4 通過抑制對乙酰氨基酚中毒所致急性肝損傷中NF-κB p65的活化，下調促炎因子TNF-α基因的表達，促進抗炎因子IL-10基因的表達，從而控制炎癥反應進程，繼而發揮其肝臟保護作用。

對乙酰氨基酚；急性肝損傷；脂氧素A4

對乙酰氨基酚是目前臨床上仍廣泛使用的退熱鎮痛藥。在正常的治療劑量之下其副作用較為少見，因而通常被認為是一種比較安全的藥品，但短時間內大量服用則會引肝臟損傷，嚴重時導致肝功能衰竭甚至死亡[1-2]。在我國，對乙酰氨基酚廣泛應用于感冒所致的發熱、頭痛的藥物。發達國家中對乙酰氨基酚肝中毒是急性肝功能衰竭所致死亡最為常見的原因之一。因此，近年來，該藥的過量使用和濫用所引起的不良反應和嚴重的肝臟毒性越發引起臨床和基礎研究者的關注[3]。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)是脂氧素(lipoxins，LXs)家族的一員，其對多種炎癥反應具有重要的調節作用，常被稱為炎癥反應的“剎車信號”，或者“停止信號”，此外，脂氧素A4在機體的免疫調解中同樣具有重要的調節作用。脂氧素A4在多種組織器官的缺血再灌注中具有保護作用，同時調節炎癥因子表達。本文使用灌胃法成功建立對乙酰氨基酚中毒的新西蘭大白兔模型。在對乙酰氨基酚中毒后期使用脂氧素A4治療，觀察脂氧素A4對于對乙酰氨基酚中毒兔肝臟損傷的保護作用，探討脂氧素A4在對乙酰氨基酚中毒所致急性肝損傷中的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性新西蘭大白兔100只(編號：16655759268231)，體質量為2.5～3.0kg，SPF級，由川北醫學院動物實驗中心提供，實驗前自由飲水，禁食24 h。

1.1.2 主要試劑：甲酯化脂氧素A4(Cayman，美國)；水合氯醛(北京化學試劑公司)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(天津市化學試劑研究所)；N-乙酰半胱氨酸(寧波科瑞生物工程有限公司)；對乙酰氨基酚(上海施貴寶制藥)；TNF-α 免疫組化S-P 試劑盒、IL-10 免疫組化S-P 試劑盒、NF-κB p65免疫組化S-P 試劑盒(英國Abcam 公司)；TUNEL 檢測試劑盒(Boehringer Mannheim 公司)；PBS 粉劑(北京中杉金橋公司)。多聚甲醛(北京中杉生物技術有限公司)；無水乙醇(江陰市瑞通化工貿易有限公司)，NF-κB p65和Anti-β-actin 抗體(Santa cruz)，辣根過氧化物酶(北京中杉金橋公司)。

1.1.3 主要設備：手提式壓力滅菌消毒器(上海申安醫療器械廠)；YJ-875S 超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；SZ-97 自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；M-6 離心機(美國Beckman 公司)； HJ-3 磁力攪拌器(深圳天南海北實業有限公司)；Eppendorf 1000 μL，200 μL，10 μL 自動移液器(德國Eppendorf 公司)；電子天平(AE200 型，瑞典梅特勒-托利多儀器有限公司)；BS60 三用恒溫水箱(北京醫療設備廠)；300 ℃恒溫烘箱(北京醫療設備廠)；HQ45 恒溫搖床(中國科學院武漢科學儀器廠)；微波爐(順德市格蘭仕電器實業有限公司)；YL3 回轉式切片機(北京手術器械廠產品)；OLMPUS AU2700全自動生化分析儀(日本OLMPUS公司)；UV-754 紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組：100只新西蘭大白兔隨機分為4組，每組25只。常規麻醉后，空白對照組給予生理鹽水灌胃；對乙酰氨基酚組(PCM組)給予對乙酰氨基酚灌胃(300 mg/kg)；N-乙酰半胱胺酸組(NAC組)在對乙酰氨基酚灌胃(300 mg/kg)24 h后，給予負荷劑量的N-乙酰半胱胺酸(140 mg/kg)靜脈注射治療；脂氧素A4 組(LXA4)在對乙酰氨基酚灌胃(300 mg/kg)24 h后，給予脂氧素A4(1.5 μg/kg)靜脈注射；各組兔均在灌胃后36 h后進行組織標本制備，并進行生化分析。

1.2.2 Western blot檢測各組兔肝臟組織內NF-κB p65的表達：將30～60 μg樣品放在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，4 ℃條件下轉膜過夜。轉膜完成后，將硝酸纖維素膜封閉液封閉，室溫輕搖1 h。一抗反應：加入用封閉液稀釋的一抗10 mL(抗NF-κB p65、actin特異抗體，1:1000稀釋)，4 ℃輕搖過夜或者室溫2 h。漂洗濾膜3次，每次10 min。二抗反應：將膜用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的相應抗體(稀釋濃度為1:2000)，室溫輕搖1 h。漂洗濾膜3次。ECL法顯色 ：將等體積ECL試劑A液、B液，混合均勻加到轉印膜上，反應5 min。暗室曝光，曝光1～2 min，顯影、定影，自來水充分沖洗。蛋白質定量分析： X光片用Mixrotek ScanWizard 5掃描軟件進行電腦掃描、Quantity one 7.0圖像分析軟件作灰度分析。

1.2.3 RT-PCR檢測肝臟組織中TNF-α及IL-10 mRNA 表達：引物 TNF-α(90bp)：5′-GGCAGGTCTACTTTGGAGTCA-TTGC-3′，5′ACATTCGA-GGCTCCAGTGAATTCGG-3′；IL-10(100bp)：5′-CCAGTTTTACCTGGTAGAAGTGATG-3′，5′-TGTCTAGGTCCTGG-AGTCCAGCAGA-3′；β-actin：5′-TGGAATCCTGTGGCATCCAT-GAAAC-3′，5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。

采用20 μL PCR 反應體系:純水12 μL，10×PCR緩沖液2 μL，25mMMgCl21 μL，10mM dNTP 0.5 μL，10 μM的上、下游引物各1 μL，Taq聚合酶1 U，DNA模板2.5 μL。PCR循環條件為: 94 ℃預變性3 min, 94 ℃變性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸50 s,共計35個循環。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以標準DNA Marker為參照鑒定PCR擴增產物。

1.2.4 免疫組化檢測NF-κBp65的表達：①組織切片脫蠟、水化、PBS洗2～3次；②滴加3%H2O2(80%甲醇)室溫靜置10 min；③PBS洗2～3次后抗原修復；④PBS洗2～3次滴加正常山羊血清封閉液，20 mn后甩去多余液體；⑤滴加Ⅰ抗(抗NF-κB p65、actin特異抗體，1:1000稀釋)37 ℃1 h，PBS洗3次；⑥滴加辣根過氧化物酶標記的相應Ⅱ抗(稀釋濃度為1:2000，加入0.05%的Tween-20)；⑦PBS洗3次，DAB顯色，鏡下掌握染色程度；⑧自來水沖洗，蘇木精復染，鹽酸酒精分化；⑨自來水沖洗、脫水、透明、封片、鏡檢。結果判斷：根據細胞染色強度分為4級，并分別記分：陰性細胞(-)無顯色；弱陽性細胞(+)顯色為淺黃色；中度陽性細胞(++)顯色為棕黃色；強陽性細胞(+++)顯色為棕褐色。

1.2.5 肝臟細胞凋亡的TUNEL試劑盒檢測：細胞固定、浸洗；加入Proteinase K處理細胞15 min，浸洗; 4%多聚甲醛固定細胞5 min,浸洗；細胞中加平衡液，濕盒平衡10 min；后滴加TUNEL反應混合液：加TUNEL反應混合溶液；暗濕盒中反應37 ℃×1 h、浸洗；之后加轉化劑-POD，在濕盒37 ℃×30 min，浸洗；加入DAB顯色(避光)，鏡下觀察顯色情況；去離子水沖洗，蘇木精復染；自來水沖洗、脫水、透明、封片、鏡檢。結果判定：細胞核固，縮有的呈碎片狀，不規則，大小不一致，呈棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。

2 結果

2.1 各組肝臟組織中NF-κB p65蛋白的表達 Western blot結果顯示，同空白對照組比較，PCM組中NF-κBp65的表達顯著升高(P<0.01)，而與PCM組相比，NAC、LXA4治療組NF-κB p65的表達顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01，見圖1)。免疫組化結果顯示，PCM組NF-κB p65陽性表達率最高，NAC組次之，脂氧素A4組較低，而空白對照組陽性表達率最低。見圖2。

圖1 肝臟組織中NF-κB p65的表達#P<0.01，與對照組比較；*P<0.01，與PCM組比較Fig.1 Expression of NF-κBp65 in liver tissue#P<0.01，compared with control group；*P<0.01，compared with PCM group

圖2 肝組織NF-κB p65表達陽性率(×400)#P<0.01，與對照組組比較；*P<0.05，與PCM組比較Fig.2 Expression of NF-κBp65 positive rate in liver tissue(×400)#P<0.01，compared with control group；*P<0.05，compared with PCM group

2.2 肝臟組織中TNF-α、IL-10表達水平 RT-PCR結果顯示，對乙酰氨基酚組肝臟組織中TNF-αmRNA水平顯著升高，明顯高于脂氧素A4組N-乙酰半胱氨酸組和空白對照組，且差異具有統計學意義(P<0.05)。相反地，脂氧素A4組中IL-10 mRNA表達水平明顯高于對乙酰氨基酚組，差異同樣具有統計學意義(P<0.05)，見表1。免疫組化結果與RT-PCR結果相符合，與對乙酰氨基酚組比較，LXA4組中TNF-α陽性表達率明顯降低，而IL-10陽性表達率顯著升高(P<0.05)，見圖3，4。

表1 細胞因子TNF-αmRNA和IL-10 mRNA的表達Tab.1 Expression of cytokines TNF-α and ±s)

#P<0.05，與對照組比較，compared with control group；*P<0.05，與PCM組比較，compared with PCM group

圖4 肝組織IL-10 表達陽性率(×400)#P<0.05，與對照組比較；*P<0.05，與PCM組比較Fig.4 The positive rates of IL-10 expression in liver tissue(×400)#P<0.05，compared with control group；*P<0.05，compared with PCM group

3 討論

本研究通過建立兔急性對乙酰氨基酚中毒模型，探討了脂氧素A4在對乙酰氨基酚中毒所致急性肝損傷中可能的保護機制。研究結果顯示，同空白對照組比較，對乙酰氨基酚組(PCM組)中NF-κB p65的表達顯著升高，而在脂氧素A4(LXA4)治療組中，NF-κB p65的表達顯著降低。于此同時，RT-PCR結果顯示，對乙酰氨基酚組肝臟組織中TNF-α mRNA水平顯著升高，明顯高于脂氧素A4組和空白對照組。相反，脂氧素A4組中IL-10 mRNA表達水平明顯高于對乙酰氨基酚組。該研究結果提示，脂氧素A4可能通過抑制NF-κB p65的活化，下調了促炎因子的表達而上調了抑炎因子的表達，從而控制了肝損傷過程中的炎癥反應進程，從而發揮其肝臟保護作用。

研究證實LXA4對缺血再灌注損傷的保護作用不僅僅局限于腎臟。實際上，ATL可以抑制由于肢體缺血再灌注引起的肺內PMN浸潤，表明LXA4和ATL可以阻止應激反應，如在圍手術期藥物使用過程中觀察到的一樣。在此過程中，LXA4和ATLa可減少兔肝臟細胞缺血再灌注誘導的趨化因子和細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子(CINC)-1表達水平[4]。另外，在阻塞大腦中動脈引起的短暫性局部腦缺血兔模型中，經腦室給與LXA4類似物可以減小梗塞體積，減輕神經系統體征。促炎癥因子TNF-β1和IL-1β的下調可以在缺血腦組織中觀察到[5]。LXA4-IL10軸似乎在缺血再灌注損傷保護機制中扮演著相關角色，因為LXA4并不能減輕IL-10缺乏小鼠的炎癥和組織損傷[6]。此外，眾多研究顯示LXA4通過抑制NF-κB p65的活性來發揮其抗炎作用。有學者[7-9]研究顯示在兔心跳驟停復蘇后，LXA4可以通過抑制NF-κB p65的活性而減輕心肌組織中的炎癥反應，從而減輕兔心肌損傷，提高其存活率。此外，有研究顯示，LXA4可以通過抑制NF-κB p65的活化而減輕巨噬細胞和腸上皮細胞中的炎癥反應[10]。本研究中，LXA4通過抑制NF-κB p65的活化，下調了促炎因子TNF-α的表達，同時促進了抗炎因子IL-10的表達，從而減輕了肝臟組織中的炎癥反應進程。眾多的研究證實，LXA4可以發揮明顯的抗炎效應，其可以通過抑制NF-κB p65的活化進而抑制促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8，以及血小板活化因子(PAF)的表達[10-12]。NF-κB p65作為轉錄因子，其也可以調控凋亡相關基因的表達，從而發揮促凋亡作用[13-15]。前一部分研究也顯示，LXA4治療組中肝細胞的凋亡明顯減輕，這或許與LXA4抑制了NF-κB p65的活化有關。

脂氧素A4可以抑制對乙酰氨基酚中毒所致肝損傷中NF-κB p65的活化，繼而抑制促炎因子TNF-α基因的表達，促進抗炎因子IL-10基因的表達，從而控制急性肝損傷中的炎癥反應進程，從而發揮其保護作用[16]。

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(編校：王儼儼，譚玲)

Role of lipoxin in preventing paracetamol-induced acute hepatic injury and its mechanism

LI Shi-qing1,DU Zong-han1,ZHOU Xiao-qing1,LUO Jun1,AN Qi-xian2,JIN Bin3

(1.Department of Gastroenterology, Second Clinical College of North Sichuan Medical College, Municipal Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, China; 2.Department of Gastroenterology, The Second People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, China; 3.Department of Clinical Medicine, Shandong University, Ji’nan 250100, China)

ObjectiveTo investigate the potential role of the lipoxin A4 in preventing paracetamol (PCM)-induced hepatic injury, and reveal its possible related signal path.Methods100 adult male New Zealand white rabbits were randomly divided into five groups, 20 rabbits in each group: Control group; PCM group; NAC group; LXA4 group; LXA4+NAC group.The rabbits were treated with paracetamol for 36 h by gastric lavage, then given NAC of NAC group,LXA4 of LXA4 group,after 24 h,the rabbits anesthetized were removed liver in which TNF-αand IL-10 were analyzed by immunohistochemistry and RT-PCR method.The expression of NF-κB p65 were detected by Western blot.ResultsThe activation of NF-κB p65 was inhibited by lipoxin A4 in patients of paracetamol-induced hepatic injury, and the expression of NF-κB p65 significantly decreased in LXA4 group compared with PCM group with statistically significant difference (P<0.01).What’s more, the expression of TNF-α and TNF-αmRNA in liver of LXA4 group decreased, conversely, IL-10 mRNA levels increased significantly, and there were statistical differences, respectively (P<0.01). ConclusionLipoxin A4 could control inflammation in paracetamol-induced acute heaptic injury via activation inhibition of NF-κB p65, down regulation of proinflammatory cytokine TNF-α level and up regulation of anti-inflammatory cytokine IL-10, which manifests a protective effect on liver protection.

paracetamol; acute hepatic injury; lipoxin A4

山東省自然科學基金(Y2008C10)

李世清，男，碩士，主治醫師，研究方向：消化道腫瘤及癌前狀態疾病、慢性肝病的防治，E-mail：lsq18258062152@126.com。

R575.3

A

1005-1678(2015)02-0088-04