熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠的建立及海馬差異表達基因的篩選研究

韋睿,張瑋Δ,于恩彥

(1.昆明醫科大學第一附屬醫院 急診科，云南 昆明 650031；2.浙江省人民醫院 精神科，浙江 杭州 310014)

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熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠的建立及海馬差異表達基因的篩選研究

韋睿1,張瑋1Δ,于恩彥2

(1.昆明醫科大學第一附屬醫院 急診科，云南 昆明 650031；2.浙江省人民醫院 精神科，浙江 杭州 310014)

目的 建立熱性驚厥(febrile seizures，FS)大鼠模型，篩選易感基因并探討其相關的機制。方法 選取50只SPF級雄性SD 大鼠21日齡，通過發病率分析篩選熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠；通過FS 敏感組和耐受組差異(gene ontology，GO)功能分析，差異Pathway 分析，差異表達基因間相互作用關系網絡分析，差異表達基因共表達網絡分析，實時定量PCR 驗證基因芯片數據方法研究其機制。結果 篩選獲得FS敏感鼠和FS耐受鼠2種不同表型的FS模型鼠；熱水浴誘導驚厥和KA誘導癲癇實驗結果表明FS敏感鼠比耐受鼠表現出更強的驚厥發作現象；2種不同表型的FS模型鼠的表達譜芯片數據分析獲得了1140個差異表達基因，其中包括602個上調基因，538個下調基因，并獲得了差異顯著的GO功能分類；差異表達基因間相互作用網絡分析與白介素-6(interlukin-b,IL-6)IL-6有著緊密的聯系；差異表達基因共表達網絡分析得到共有174 個共表達能力發生巨大變化的基因。 同時，實時定量PCR驗證結果與基因芯片表達一致，表明基因芯片數據的可靠性。結論 2種不同表型FS 模型鼠的建立提示表觀遺傳機制可能參與FS 疾病的發生發展；大鼠海馬全基因組表達譜芯片分析結果提示免疫炎癥、離子通道、代謝等多種因素可能在FS 發生發展中起重要作用。

熱性驚厥；基因芯片；差異表達基因

熱性驚厥(febrile seizures，FS)，是一種發生在嬰幼兒和兒童時期常見的、伴有體溫升高的中樞神經系統功能異常癲癇綜合征，通常與發熱有關，但沒有明顯的中樞神經系統感染[1-3]。有關研究顯示，FS的發病率在歐美國家為2%～5%，中國為5%～6%，日本為6%～9%，西太平洋馬利亞群島則為11.4%，并且表現出明顯的種族和地域的差異性，具有典型特征的促發因素(高熱)和發作年齡范圍(6月～6歲)[4-5]。流行病學調查顯示復雜型FS患者發生癲癇的相對危險性是一般兒童的10倍，嚴重影響廣大兒童患者的身心健康和智力發育[6-7]。盡管多數FS是自限性的，但少部分病人后來演變為非熱驚厥。復雜型FS被認為能夠導致海馬及顳葉硬化，它們是導致癲癇發生的病理基礎。目前，關于FS疾病的確切發病機制尚不清楚。本研究旨在通過建立新的FS動物模型，采用高通量基因組學技術，篩選新的FS遺傳易感基因，對于闡釋FS的發病機制及其內在聯系具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：50只SPF級雄性SD大鼠(21日齡)，體質量為50～54 g，由昆明醫科大學動物實驗中心提供(動物合格證號：2013A032)。動物飼養室溫20 ℃，相對濕度60%，每日光照12 h，自由攝食、飲水。定期打掃衛生，保持環境整潔，并注意避免非特異性應激反應的發生。動物使用和處理遵照美國國立衛生署頒布的《實驗動物關護和使用指南》。

1.1.2 主要試劑和儀器：水合氯醛、青霉素、KA均購自南京建成，DNA提取試劑盒購自Santa Cruz。

恒溫的水浴箱、高恒溫水浴箱(Selby Scientific and Medical，美國)；紫外凝膠成像儀(Vilber Lourmat 公司，法國)；電泳儀(北京東方儀器廠)；電子天平(METTER TOLEDO 公司，型號：PL203)；不銹鋼滅菌鍋(上海申安醫療設備，型號DSX-280A)。

1.2 方法

1.2.1 熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠的建立：FS動物模型的篩選方法：第一代選取50只21日齡雌雄各半野生型SD大鼠，根據經典的熱水浴誘導驚厥模型的方法[8]，將大鼠放入一個透明的玻璃筒中(直徑6 cm，高20 cm)，此玻璃筒下部有多個小孔與外部相通。將筒豎立于恒溫(45.00±0.25) ℃的水浴箱中，通過向玻璃筒底墊放塑料墊片以調節筒中水的深度，以大鼠沿筒壁站立時僅能露出頭部為準，水浴4 min；對熱水浴處理的大鼠進行攝像，雙盲法記錄大鼠發作的潛伏期、持續時間、發作等級。驚厥潛伏期(min)：水浴開始至開始發生驚厥之間的時間。驚厥持續時間(min)：開始發生驚厥至驚厥停止之間的時間。按照FS的5級行為學評分標準[9]：0級為未發生驚厥；1級為面部抽動；2級為點頭、甩尾；3級為一側前肢抬起陣攣；4級為全身強直，雙側前肢抬起、痙攣；5級為全身強直陣攣，跌倒。篩選出FS最敏感鼠和最耐受鼠并模擬人類遺傳方式進行交配繁殖下一代。按照同樣的篩選流程獲得第二代FS最敏感鼠和最耐受鼠，以此類推。除了記錄動物行為學指標外，還通過檢測熱水浴誘導之后大鼠腦電圖指標變化情況進一步確定該模型篩選方法的正確性及可靠性。

FS大鼠腦電圖記錄方法：選取21日齡FS敏感大鼠和耐受大鼠各6只，以水合氯醛腹腔麻醉(劑量為350 mg/kg)，俯臥位固定，使頭頂部保持水平，剪開頭頂部皮膚，分離皮下組織，剝離刮掉骨膜，暴露顱骨；分別在顱骨相應位置用小型電鉆鉆一小孔。海馬電極坐標，前囟后7.5 mm，中線左右旁開2.5 mm，硬腦膜下深度2.5 mm；將高壓消毒后電極短端植入小孔，用調好的玻璃離子體水門汀把電極固定于顱骨。全部操作過程無菌操作，術后每只小鼠肌注青霉素2000 U/d，連續3 d。電極埋置7 d后，大鼠行為狀態未見異常。準備進行海馬腦電圖的記錄。首先將電極導線端與信號采集系統連接，線路連通后運行軟件，設置腦電圖記錄參數(紙速3 cm/s，敏感度50 μV/5mm)，待穩定后監測腦電圖。水浴前5 min，記錄FS敏感組鼠大和耐受組大鼠正常情況下的基礎腦電，待基礎腦電穩定后，將FS敏感組鼠大和耐受組大鼠放入45 ℃水浴中4 min，記錄2組模型鼠腦電圖的變化，并由另外一名人員記錄2組模型鼠的行為學的變化。

KA誘導大鼠癲癇模型：選取第二代21日齡FS敏感組雄性大鼠和耐受組雄性大鼠各5只，腹腔注射KA(3 mg/mL)，按照FS的5級行為學評分標準進行等級評分。

1.2.2 熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠海馬全基因組表達譜芯片分析：FS敏感組和耐受組差異(gene ontology，GO)功能分析：對于上述篩選的差異表達基因，通過NCBI、Swissprot/Uniprot、AmiGO等多個數據庫的信息對其進行GO功能注釋分析，通過計算富集倍數(enrichment fold)和P值(Fisher檢驗)，可以鑒定出該基因群中顯著富集的GO功能類別。

FS敏感組和耐受組差異Pathway分析：通過整合KEGG、Biocarta、Reactome等多個數據庫信息，利用超幾何分布的Fisher精確檢驗的方法對差異表達基因所參與的Pathway進行顯著性分析。

差異表達基因間相互作用關系網絡分析：通過整合Pubmed textmining、同源預測、基因neighbor、蛋白-蛋白相互作用、基因融合等數據，建立一個包含所有差異表達基因的單節點的調控網絡。

差異表達基因共表達網絡分析：通過基因芯片模擬生物信息學軟件構建基因共表達網絡，基因在芯片上的表達信號強度的變化反映了基因間的內在聯系及動力學過程。根據基因芯片實測數據的相關性，預測基因間存在的共表達關系，以此構建基因間的共表達作用網絡。然后根據圖論原理計算出每個基因在網絡中的共表達能力。

實時定量PCR驗證基因芯片數據：為了驗證大鼠全基因組表達譜芯片數據的可靠性，選取10個差異表達基因，通過實時定量PCR的方法進行驗證。首先，提取海馬組織樣本的總RNA，利用逆轉錄試劑盒(Fermentas)將RNA逆轉錄成cDNA作為模板。根據每個基因的cDNA序列設計特異的熒光定量PCR引物初步檢物初步檢測各個基因的表達情況；按照天根熒光定量試劑盒標準操作方法操作[10]。

國有企業改革要以完善的財務管理預算體系為基礎，通過在經營管理過程總有效的編制財務預算，從而促進建立、健全各種財務規章制度。預算管理要充分發揮國有企業管理層次的引導作用，以管理者為突破口，強化其財務預算管理的意識，來調動管理層進行有效財務預算觀的積極性，將預算管理能夠切實的落到實處。除此之蛙，要做好國有企業員工的思想教育工作，采取各種措施進行財務預算管理培訓，以此來增強全員對財務管理預算的認識。

2 結果

2.1 熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠的建立

2.1.1 FS動物模型的篩選：對有癲癇發作或者耐受41.0 ℃大鼠進行雜交，尋找F1子代中有癲癇發作的后代，進行純化，尋找F2代中的純合子，將F2代的純合子進行純化，以此類推尋找F3、F4代。2組不同表型FS模型大鼠家系圖譜見圖1。

圖1 2組不同表型FS家系大鼠圖譜Fig.1 Atlas of FS family rats in 2 different phenotypes

FS模型鼠發病率分析：通過分析2組FS發病率，從F0～F4代，經過熱水浴誘導，當大鼠核心體溫到達41 ℃時，FS敏感鼠的發病率從25%升高至71.4%。而在核心體溫為43 ℃時，FS耐受鼠發病率從62.5%逐漸降低至28.6%。結果顯示，通過人工定向篩選，FS敏感鼠和耐受鼠的表型逐漸的分離開來，具有不同的溫度敏感性。見圖2。

圖2 五代(F0～F4)FS敏感鼠與耐受鼠發病率分析Fig.2 Sensitivity analysis of the incidence of FS and tolerance in rats of five generation(F0～F4)

2.1.2 熱水浴誘導后FS敏感組與耐受組大鼠腦電圖分析：對2組模型鼠腦電圖結果分析發現，FS敏感鼠的腦電與耐受鼠腦電相比，表現出高幅度和高頻率。FS敏感鼠(圖3A上)和耐受鼠(圖3A下)水浴后腦電發作經放大后(圖3B上，圖3B下)發現2組都呈現尖波發作。經過腦電圖功率圖譜的統計分析，FS敏感組大鼠腦電功率與FS耐受組大鼠腦電功率差異顯著(P<0.001)見圖3C。同時EEG結果顯示FS敏感組比耐受組表現出嚴重的驚厥行為。因此，圖3結果可推斷出FS敏感組比耐受組具有更強的高熱敏感性。

P<0.05，與耐受鼠相比，compared with tolerant rats圖3 45 ℃熱水浴誘導后FS敏感鼠與耐受鼠腦電圖分析Fig.3 EEG analysis of FS sensitive rats and tolerant rats after induced by 45 ℃ hot water bath

2.1.3 KA誘導后FS敏感組與耐受組大鼠腦電圖分析：觀察腦電圖可以看出，敏感鼠和耐受鼠腦電圖在大部分頻率波段范圍內，KA誘導后發生改變，敏感鼠的腦電圖變化幅度較大，見圖4A。圖4B表明FS敏感組大鼠的平均腦電功率明顯高于耐受鼠。FS敏感組大鼠的發作潛伏期顯著低于耐受組大鼠的發作潛伏期(P<0.05)，見圖4C。記錄驚厥等級結果發現，FS敏感組大鼠的發作等級最高，100%的大鼠出現了5級驚厥行為，而耐受組大鼠僅有20%出現了3級以上的驚厥行為(圖4D)，2組模型鼠相比差異有統計學意義(P<0.05)。結果提示，與FS耐受組大鼠相比，FS敏感組大鼠對KA誘導癲癇的發生更加敏感。

圖4 KA誘導后FS敏感鼠與耐受鼠腦電圖分析*P<0.05，與耐受鼠相比Fig.4 EEG analysis of FS sensitive rats and tolerant rats after induced by KA*P<0.05，compared with tolerant rats

2.2 熱性驚厥敏感鼠與耐受鼠海馬全基因組表達譜芯片分析

圖5 差異GO功能分析Fig.5 Analysis of difference between GO function

2.2.2 差異表達基因間相互作用網絡分析：IL-6作為一個重要的FS易感基因位于基因網絡關系圖的中心，它可能在FS疾病的發生發展過程中起到更加重要的作用。其他的差異表達基因(如APOA5，S100A8，KCNMA1，DPP4)與IL-6有著直接或間接的聯系。按照同樣的方法，本研究將篩選的免疫相關的差異表達基因構建基因間分子網絡，在免疫相關基因的分子網絡中，IL-6也位于分子網絡的中心，其他的免疫相關基因(如S100A9，DPP4，STAT5A)與IL-6有著緊密的聯系。這些分子網絡中的差異表達基因可能在FS疾病的發生發展中起到重要的作用。上述實驗結果可以推斷出FS與免疫炎癥因素存在緊密相互關系。見圖6。

圖6 差異表達基因間相互作用關系網絡圖Fig.6 The interactions between network map of differentially expressed genes

2.2.3 差異表達基因共表達網絡分析：通過比較FS敏感組和FS耐受組網絡結構及基因的共表達能力，最終得到共有174個共表達能力發生巨大變化的基因。在共表達網絡中，通過K值來表示基因功能的相似性，K值越高代表這個基因可能起到的作用越大。通過分析K值發現共有38個差異表達基因可能在FS疾病的發生發展中起到關鍵的作用，其中包括溶質轉體家族(Slc18A2，SLC6A4)，離子通道家族(Scn5a，Kcnma1，Kcnq4)，嗅覺受體(Olr1253，Olr1679，Olr536)等。以上結果分析顯示，這些共表達基因可能在FS疾病的發生發展中起到非常重要的作用。見表1。

表1 共表達網絡分析結果Tab.1 Analysis results of co-expression network

2.2.4 基因芯片可靠性驗證：為了進一步證實基因芯片的質量及芯片數據的可靠性，本文在1140個差異表達基因中，選取了10個差異表達基因(5個上調基因，5個下調基因)(圖7A)利用實時定量PCR進行驗證。結果顯示，定量PCR的驗證結果(圖7B)與基因芯片的結果相符，證明基因芯片這種方便快捷，高通量，大規模的基因表達研究技術是值得信賴的。見圖7。

圖7 差異表達基因的驗證Fig.7 Identity of differentially expressed genes

3 討論

本文通過經典熱水浴誘導驚厥并結合人工定向選擇篩選的方式成功獲得了2種不同表型的FS模型鼠。這2種模型鼠的建立為后期尋找新的FS易感基因進而闡明FS的發病機制提供了良好的基礎。本文對差異表達基因進行了深入的信息挖掘分析，獲得了與FS相關的差異性GO。上調差異表達基因所參與的差異GO主要與干擾素、IL-6、IL-3的細胞反應有關，下調差異表達基因所參與的GO主要與T細胞的增殖和免疫系統進程相關。這些免疫相關GO功能信息提示FS與免疫炎癥之間存在著密切的關系，對于研究免疫炎癥在FS中的作用提供了重要線索。最新研究表明，免疫和炎癥進程在FS中作用非常重要[11]，特別是由于感染、神經創傷等與癲癇相關的因素引起的先天免疫機制和隨后的炎癥反應。一些相關的炎癥信號通路被證明與FS的發生有關，例如Toll樣受體信號通路、NF-κB，MAPK信號通路。在上調差異pathway中存在類固醇激素的生物合成通路，類固醇激素主要包括糖皮質激素、皮質酮、孕激素等，類固醇激素可以作為中樞神經系統內重要的信息傳遞物質，與神經細胞的興奮性和突觸可塑性有著密切的關系。同時，該通路與表觀遺傳效應存在密切關系，這些激素可以通過與其各自受體相互作用影響基因的表觀遺傳修飾，例如組蛋白甲基化、乙酰化，進而可以影響動物的行為表現[12]。這些信息提示表觀遺傳機制可能會影響FS的發生發展。此外，在差異表達基因及差異pathway中，發現一些代謝相關的基因和信號通路。例如，APOA5、APOC3、PPAR信號通路、細胞色素CYP450代謝通路、花生四烯酸代謝通路等，提示FS可能與代謝相關基因及其信號通路存在緊密的聯系。

另外，本文從1140個差異表達基因中選取免疫相關差異表達基因，利用相關的數據庫信息構建了差異表達基因間相互作用關系圖。在基因相互作用關系圖中，發現IL-6位于基因網絡關系圖中心位置，提示它可能起到關鍵作用。盡管IL-6在正常的大腦中出于低表達水平，但是驚厥誘導后其基因表達水平迅速升高[13]。IL-6過表達可以通過削弱海馬中GABA神經元的抑制作用進而增加驚厥敏感程度[14]。另外1個免疫相關基因-DPP4(又稱CD26)，在基因網絡圖中與IL-6有直接的聯系，提示2個基因間的相互作用可能會影響FS的發生發展。DPP4是一種T細胞表面抗原，同時它作為一種二肽基肽酶可以水解多種不同的底物，包括胃腸激素(GLP-1)、神經肽類(NPY)、趨化因子類(CCL3，CXCL10)等[15]。先前的研究表明，GLP-1可以通過GLP-1R受體信號通路減弱驚厥發作。將小鼠的GLP-R受體敲除后中發現可以增加驚厥的嚴重程度和神經元的興奮性。DPP4的另外一種底物-神經肽Y，可以通過其受體抑制驚厥的發生。DPP4抑制劑也可以減弱由于糖尿病引起的IL-6和IL-1β的表達升高。在FS敏感組中，差異表達基因IL-6和DPP4基因表達上調，結果顯示免疫炎癥可能在FS中起到重要的作用。

綜上所述，通過對大鼠海馬表達譜基因芯片的分析，獲得了一些候選易感基因和重要的差異GO功能、差異信號通路、差異基因間的相互作用網絡關系及共表達網絡關系，為闡明FS發病機制提供很好的線索。

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(編校：王冬梅)

Construction of febrile seizures sensitive,tolerance rats and screening of differential expression genes of febrile seizures hippocampus

WEI Rui1, ZHANG Wei1Δ,YU En-yan2

(1.Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650031, China; 2.Department of Psychiatry, People’s Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310014, China)

ObjectiveTo establish the animal model of febrile seizures(FS), screen susceptibility genes and investigate the related pathogenesis.Methods50 SPF male SD rats (aged 21 days) were selected,screened febrile seizure sensitive and tolerant rats by the incidence of FS.Differences in gene ontology (GO) function,pathway,network interaction of genes differential expression,and differential expression of gene co-expression network were analyzed between FS sensitive group and tolerant group.The validation of gene chip data method was analyzed by Real-time PCR.ResultsAccess to two different phenotypes of FS rat model of screening,including FS sensitive rats and FS tolerance rats.After 43 hot water bath treatment,the incidence of FS sensitive rats rate with increasing passage number and gradually increase.Hot water bath induced seizures and KA induced epilepsy experimental results showed that the FS sensitive rats exhibited stronger seizure phenomenon than tolerance rats.Obtained 1140 differentially expressed genes by expression of two different phenotypes of FS rat models in microarray data analysis,including 602 up-regulated and 538 down regulated genes,and obtained the GO functional classification differences.Differentially expressed genes interaction network analysis showed that were closely with IL-6,The co-expression network analysis,there were 174 gene of co-expression ability changed tremendous. At the same time,real time quantitative PCR validation results consistent with gene chip expression,showed that the reliability of microarray data. ConclusionRat model of FS suggested that epigenetic regulation may play an important role in the pathogenesis of FS.Meanwhile,rat hippocampal gene microarray results suggest that many factors (immunity，ion channels，metabolism et.al) may paly a vital role in the pathogenesis of FS.

febrile seizures; microarray; differential expression genes

2011年省醫藥衛生計劃(2011KYA012)

韋睿，女，本科，主治醫師，研究方向：急診醫學，E-mail:qch1821460080@163.com；張瑋，通訊作者，男，碩士，副主任醫師，研究方向：重癥醫學，E-mail:qch1821460081@163.com。

R363

A

1005-1678(2015)02-0074-06