開口箭對S-180細胞和實體瘤的抑制作用研究

戚利坤,王俊,劉洪澤,張聲林,蔡浩,洪鳴

(1.青海省第五人民醫院 腫瘤外科，青海 西寧 810007；2.南京醫科大學 醫學科學部，江蘇 南京 210029)

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開口箭對S-180細胞和實體瘤的抑制作用研究

戚利坤1,王俊1,劉洪澤1,張聲林1,蔡浩1,洪鳴2

(1.青海省第五人民醫院 腫瘤外科，青海 西寧 810007；2.南京醫科大學 醫學科學部，江蘇 南京 210029)

目的 研究開口箭(Tupistra chinensis Baker)對S-180細胞及其實體瘤的抑制作用。方法 SPF級BALB/c-nu小鼠30只，將腫瘤生長良好且小鼠精神狀態佳者進行隨機分為5組，每組6只：生理鹽水組，開口箭低劑量組，開口箭中劑量組，開口箭高劑量組，環磷酰胺(cytoxan,CTX)組。觀察細胞形態變化及實體瘤生長狀況；用流式細胞術檢測各組S-180細胞DNA含量及周期，比較各組對腫瘤細胞生長周期的影響；利用透射電鏡觀察開口箭干預各組實體瘤細胞超微形態結構的變化。結果 實驗結果發現S-180細胞呈圓形或橢圓形，于接種第10天剝取實體瘤，瘤體組織生長良好；開口箭將S-180細胞生長周期阻滯在S期；電鏡下開口箭各組細胞形態不規則，染色質凝聚、邊緣化，細胞核固縮，與生理鹽水組和CTX組比較有明顯結構改變。結論 開口箭對S-180細胞及其實體瘤均有明顯抑制作用，開口箭阻滯S-180細胞生長周期，導致細胞形態的變化，誘導腫瘤細胞凋亡。

開口箭；S-180細胞；抗腫瘤機制

隨著分子生物學和分子藥理學在中藥單方和復方領域的廣泛開展，中藥制劑已從宏觀到微觀，從整體到局部，從整體—部位—成分3個化學層次、從整體動物—組織器官—細胞—分子基因4個藥理水平確定藥效物質；通過計算機輔助藥物設計分析技術，血清藥理學和血清藥物化學分析方法，譜效關系分析，生物色譜技術，蛋白質組、基因組學系統生物學等研究方法[1]，成功研究出生物堿類、萜類、皂苷類、甾體類、黃酮類、蒽醌類、鞣質類等主要有效成分及其衍生物的藥效基團[2]。大量研究總結認為中藥抗腫瘤的作用機制主要有：抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡，逆轉腫瘤藥物的多耐藥性，抑制腫瘤血管的生成，抗氧化作用，抑制腫瘤細胞拓撲異構酶活性，抑制直接細胞毒作用，阻斷腫瘤細胞遷移通路及基因水平調節以及增強機體的免疫力等等[3-7]。本文以具有清熱解毒、散瘀止痛、益氣活血等多種功效的開口箭為研究對象，探討其對S-180肉瘤細胞抑制作用，探討清熱解毒類中藥—開口箭抑制腫瘤的可能機制。

1 材料與方法

1.1 S-180細胞與實驗動物 S-180細胞株購于中國生物典型培養物保藏中心(武漢)；SPF級BALB/c-nu小鼠30只，雌性，4～6 w，平均體質量16～20 g，購于武漢大學動物實驗中心(合格證號：SCK鄂2008-0004)，在中南醫院動物中心喂養，本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 主要試劑 RPMI1640美國GIBCO公司；胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司；開口箭飲片渦陽縣源和堂中藥飲片有限責任公司；環磷酰胺200 mg/支(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號11013121)；氟尿嘧啶250 mg/10mL(天津金耀氨基酸有限公司，批號1012221)；焦碳酸二乙酯(DEPC)美國Sigma公司；二苯基四氮唑溴鹽(MTT)碧云天生物技術研究所；DMSO(二甲基亞砜)；化學發光法EMSA試劑盒。

1.3 實驗方法

1.3.1 開口箭藥物制備：稱取開口箭飲片(神農架產區)0.5 kg，自來水浸泡30 min，分煎2次得濃度為0.16 g/mL溶液，冷卻后用無菌紗布過濾2次，分瓶置4 ℃保存，體外實驗時用0.22 μM微孔針頭濾器過濾，并用蒸餾水或者PBS調整至需要濃度，體內灌胃時提前30 min移至室溫。

1.3.2 實驗動物分組：將腫瘤生長良好且小鼠精神狀態佳者進行隨機分為5組，每組6只。生理鹽水組，在普食的基礎上給予生理鹽水灌胃；開口箭低劑量組，在普食的基礎上給予開口箭0.5 g/kg；開口箭中劑量組，在普食的基礎上給予開口箭1 g/kg；開口箭高劑量組，在普食的基礎上給予開口箭2 g/kg；以上各組均為灌胃給藥。CTX組，在普食的基礎上按體質量給予環磷酰胺0.02 g/kg腹腔注射[8]。每天1次，干預2周后，乙醚麻醉剝取腫瘤，并行相關形態學和生化檢測。

1.3.3 流式細胞術檢測S-180細胞DNA含量及其周期：收集懸浮細胞于5 mL離心管中，1200 r/min離心5 min；倒掉上清液，每管加入1 mL 14 ℃預冷的PBS重懸細胞；轉移至1.5 mL的離心管，以1200 r/min，5 min沉淀細胞；倒掉上清液，并輕彈管底，每管加入1 mL 14 ℃預冷的75%乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定過夜；以1500 r/min，5 min沉淀細胞，倒掉上清液，并予1 mL 14 ℃預冷的PBS，1500 r/min離心5 min，清洗細胞2次；輕彈管底分散細胞，每管加入0.5 mL的碘化丙啶染色液(加入前約5 min按6個樣本的量配制)，輕輕吹打細胞懸液，37 ℃孵育30 min后；用200目篩網過濾，并轉移至流式管后上機檢測。

1.3.4 電鏡切片制作[9]：在無菌條件下取出腫瘤組織，去胞膜，將其切成5 mm方形，用2.5%戊二醛固定液前固定2 h后，用0.1M磷酸緩沖液漂洗3次，然后用1%鋨酸后固定90 min，pH 7.2～7.4，固定完畢，用緩沖液漂洗20 min后分別用50%、70%、80%乙醇各1次，每次各15 min，100%乙醇2次，每次15 min進行梯度脫水，然后環氧樹脂812包埋，最后用枸櫞酸鉛進行切片染色。

2 結果

2.1 S-180肉瘤細胞及其實體瘤生長狀況 S-180肉瘤細胞呈圓形或橢圓形，均勻懸浮在培養瓶中，生長狀態良好，平均每1～2 d傳一代。肉瘤細胞接種BALB/c-nu小鼠后于第5 d可見實體瘤突起，于接種第10 d剝取實體瘤，瘤體組織生長狀態良好。見圖1。

圖1 S-180肉瘤細胞及其實體瘤生長狀況Fig.1 The growth status of S-180sarcoma cells and solid tumor

2.2 流式細胞術檢測S-180細胞周期 碘化丙啶染液能夠透過凋亡中晚期的細胞和死細胞膜，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度使細胞核紅染，結合細胞的DNA含量分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期。由表1可知開口箭對S-180細胞生長周期的阻滯在S期，而且隨著濃度的增加阻滯在S期的比例越大，說明開口箭可阻滯細胞生長，誘發S-180肉瘤細胞的凋亡。見表1。

表1 開口箭對S-180細胞周期的影響Tab.1 Effect of Tupistra chinensis on S-180 cell cycle

2.3 透射電鏡實體瘤細胞的形態學變化 凋亡是細胞受基因調控的一種自然死亡過程，是多細胞生物生命活動中不可缺少的過程。從形態學上認定細胞變化是最直接判定細胞凋亡的方法。電鏡下可見對照組實體瘤細胞體積變小，細胞質濃縮，細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象的空泡結構，甚者有細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化，可見凋亡小體；開口箭各組細胞體積無明顯縮小，細胞核染色質無明顯凝聚邊緣化，低、中、高劑量組隨著劑量的增加，細胞變化與陽性對照組越接近，見圖2。

圖2 電鏡下各組實體瘤超微結構改變Fig.2 Ultrastructural changes of solid tumor groups under electron microscopy

3 討論

現代化研究認為中藥抗腫瘤機制與多因素有關。高靜東等[12]研究認為清熱解毒中藥具有下調MMP-9表達及上調TIMP-1表達的作用,與養陰、補腎、健脾類中藥相比有顯著性差異。臨床也有諸如白花敗醬草提取物對小鼠U14宮頸癌細胞的抑制作用，認為可能與其調節小鼠免疫功能，增強抗氧化防御系統酶活性有關[13]。連翹提物物對大腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤細胞均抑制作用，半數抑制濃度平均值為191.88 μg/mL，分析可能與下調細胞中凋亡相關蛋白Survivin mRNA和Bel-2mRNA有關[14]。

本實驗證實開口箭對S-180細胞抑制作用，認為開口箭對腫瘤細胞具有抑制作用，可明顯抑制S-180肉瘤細胞的增值，阻滯其生長周期。開口箭抗腫瘤的具體有效成分和分子機制，有待于進一步研究。

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(編校：譚玲)

Study on Tupistra Chinensis Baker’s role on inhibiting S-180 cell and solid tumors

QI Li-kun1,WANG Jun1,LIU Hong-ze1,ZHANG Sheng-lin1,CAI Hao1,HONG Ming2

(1.Department of Surgical Oncology, The Fifth People’s Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, China; 2.Department of Medical Sciences, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo study the Tupistra chinensis Baker’s inhibition on S-180 cells and solid tumors.MethodsSPF 30 BALB/c-nu mice, the tumor growth in mice and good mental state better were randomly divided into 5 groups, 6 rats in each group: normal saline group, Tupistra chinensis Baker low dose group, middle dose group, high dose group, CTX group.The morphological changes of cells and solid tumor growth status were observed;S-180 DNA content and cell cycle in each group were detected by flow cytometry,the changes of ultrastructure of each intervention group were observed by transmission electron microscope.ResultsThe experimental results showed that the S-180 cells were round or oval, inoculation in article 10 d stripping of solid tumors, tumor tissue growth was good; cells were irregular under electron microscope,chromatin condensation and marginalization, karyopyknosis, which had a significant structural change compared with normal saline group and CTX group. ConclusionTupistra chinensis Baker has inhibitory action on S-180 sarcoma cells and solid tumor.Tupistra chinensis Baker-could block S-180 cell cycle, resulting in changes in cell morphology, inducing tumor cell apoptosis.

Tupistra chinensis Baker; S-180 cells; antitumor mechanism

國家自然科學基金(81100352)

戚利坤，男，本科，主治醫師，研究方向：腫瘤學，E-mail：qch1821460066@163.com。

R2-031

A

1005-1678(2015)02-0045-03