利用DNA洗牌技術一次性克隆多個基因

王肖猛,孟祥潮,曹雪松

(聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252300)

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利用DNA洗牌技術一次性克隆多個基因

王肖猛,孟祥潮,曹雪松

(聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252300)

目的 探討DNA洗牌技術(DNA shuffling)對蛋白質組學和代謝組學等研究的意義。方法 利用DNA洗牌技術一次性克隆多個基因片段到表達載體，并同時突變基因內部的2個氨基酸位點，PCR、酶切、測序檢測構建表達載體的準確性。結果 成功地一次性克隆了3個編碼小RNA的串聯短片段MSb1、MSb2、MSb3以及3個蛋白編碼基因FokI、MS2、FokI，并一次性將PLRV-P0基因內部2個編碼色氨酸(W)的密碼子TGG突變為編碼丙氨酸(A)的GCG密碼子。結論 DNA洗牌技術可應用于基因組學、多基因功能鑒定、融合基因表達和一次性構建基因內部多個點突變的研究，具有精確、快速和高效的特點。

DNA洗牌技術；基因；克隆

隨著人類及越來越多生物的全基因組測序的完成，功能基因組研究需要快速和高通量基因克隆技術以用于研究代謝組學、蛋白質組學等，甚至于合成含有多個基因的新組合生物體系[1-6]。近年來開發了一些新技術以用于多片段、高通量DNA的克隆，已得到商業化推廣的高通量克隆技術是位點特異性重組克隆系統(site-specific recombinational cloning systems)，包括GATEWAY系統[7-9]和In-fusion系統[10-12]。雖然這些技術已被廣泛使用，但依然存在以下缺陷：①2種系統都需要將目的基因先通過重組反應克隆到入門載體(entry vector，gateway system)或控制載體(master vector，in-fusion system)，再通過一步重組反應將基因克隆到目的表達載體，因此操作步驟繁瑣；②由于需要二步反應，加之參與反應的酶不止一種，因而費用較高；③在目的載體中基因兩側或一側會產生多余的堿基(Gateway技術在基因兩側產生25個，In-fusion技術在基因上游產生34個堿基)。當需要克隆多個串聯基因或在基因的兩端加上標簽時會產生多余的連接氨基酸(分別為8和11個)；④需要特定的載體系統。所用載體都含有重組反應所需的特定序列，因而載體需經過改造，并且不能與現有載體實現共享。

DNA“洗牌術”又稱DNA改組技術[13-18]，或DNA體外隨機拼接技術，它的原意是指將來源不同但功能相同的一組同源基因，用核酸酶Ⅰ消化成隨機片段，由這些隨機片段組成一個文庫，使之互為引物和模板進行PCR擴增，當一個基因拷貝片段作為另一基因拷貝的引物時，引起模板互換，重組因而發生。DNA洗牌術為基因克隆和載體構建技術提供了新思路，從而達到方便、快捷和節約克隆基因的目的。本文旨在通過PCR，結合DNA洗牌技術原理和傳統酶切-連接克隆技術，分別將3個基因片段及3個小片段DNA串聯克隆入表達載體。采用一步法定點突變基因內部2個氨基酸位點，以期省略傳統克隆所需的分步酶切-連接的繁瑣步驟，提高多基因(或DNA片段)和產生多位點突變基因的克隆效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株:載體質粒pCAMBIA1305和pUC-24MS2以及pGR107來自本實驗室，pST1374購于Addgene公司，大腸桿菌E.coli DH5α菌株為本實驗室保存，感受態為本實驗室自制。

1.1.2 工具酶和試劑：質粒小量抽提試劑盒和DNA膠回收試劑盒(AXYGEN)購于Promega公司，EcoR Ι等各種限制性內切酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer、卡那霉素、氨芐霉素以及T4 DNA連接酶均購于Takara公司。

1.1.3 合成和測序：引物合成在北京三博遠志生物技術有限責任公司，測序在上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 一次性克隆三個串聯短片段DNA：首先用傳統構建載體的方法在多克隆位點中插入Polymerase III類的啟動子AtU6，可以啟動小RNA基因的表達。該載體命名為p1305-U6，利用該載體中U6啟動子下游的Kpn I和Hind III二個酶切位點，通過DNA 洗牌方法一次性克隆3個與MS2噬菌體外殼蛋白結合的小RNA基因片段(MS binding，MSb)。根據文獻報道合成MSb堿基序列，設計并合成引物見表1。

表1 合成MS 結合的PCR引物Tab.1 PCR primers for MS binding gene

將化學合成的6條寡聚核苷酸鏈(5’端磷酸化修飾)分為MSb1F和MSb1R、MSb2F和MSb2R、MSb3F和MSb3R 3組，每組2條寡聚核苷酸均溶于TE緩沖液,然后每組2條寡聚核苷酸以等摩爾混合，分別經高溫變性、退火形成互補雙鏈，其中每兩組之間的3’端和5’端分別含有互補的粘性末端，以形成按順序銜接、相互串聯的3個DNA片段。

1.2.2 一次性克隆3個編碼蛋白基因：通過DNA 洗牌方法一次性克隆3個長片段串聯基因，即形成FokI:MS2:FokI。設計并合成引物見表2。

表2 FokI和MS2基因的PCR引物Tab.2 PCR primers for FokI and MS2 genes

以pST1374為模板，FokI1F和FokI1R為引物，進行PCR擴增，其兩端分別引入Nco I和Xba I酶切位點。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，進一步用回收試劑盒回收目的產物，得到目的片段FokI。以質粒pUC-24MS2為模板，WMS2F和WMS2R為引物，采用上步方法獲得目的片段MS2，兩端分別引入限制性酶切位點XbaⅠ和BamHⅠ。同樣方法得到第2個FokI片段，其兩端引入酶切位點BamHⅠ和BstEⅡ，這樣得到3組雙鏈DNA，用相對應的限制性內切酶酶切并膠回收上述3個PCR片段，每2組之間的3’端和5’端都含有互補的粘性末端，形成按順序銜接、相互串聯的3個融合基因。

1.2.3 一次性克隆并突變基因內部的2個氨基酸位點：PLRV-P0 能夠和宿主AGO 1蛋白發生相互作用，其序列中2個重復的WG 基序是其與AGO1蛋白相互作用的關鍵氨基酸。通過DNA 洗牌方法，一次性將PLRV-P0基因序列中第 87 位和第 140 位的編碼色氨酸(W)的密碼子TGG突變為編碼丙氨酸(A)的GCG，并克隆到植物表達載體pGR107。質粒pGR107中含有酶切位點ClaⅠ和SalⅠ，根據PLRV-P0的基因序列，設計合成含有相關酶切位點的引物，見表3。

表3 突變2個氨基酸位點的PCR引物Tab.3 PCR primers for two amino acid sites mutation

將合成的6條引物分為P0F和P0WA87R、P0WA87F和P0WA140R、P0WA140F和P0R 3組，分別命名為PW1、PW2、PW3，每組2條引物以等摩爾混合。以pER8(含PLRV的基因組)為模板，分別用3對引物進行PCR擴增。其中PW1 、PW2、PW3的兩端分別引入限制性酶切位點Cla Ⅰ和BspQ Ⅰ、BspQ Ⅰ、BspQ Ⅰ和Sal Ⅰ，經相應的雙酶切并切膠回收以后3’端和5’端分別含有互補的粘性末端，以形成按順序相互串聯的3個DNA片段。

1.3 退火及PCR程序 退火反應程序為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30s，60 ℃ 退火30s，72 ℃延伸30s進行30個循環，最后72 ℃延伸5 min。 PCR反應體系50 μL，含Pfu DNA聚合酶0.1 μL，10×PCR buffer 5 μL(含有Mg2+)，10mmol/L dNTP 1 μL，模板DNA 1 μL(200 μg/的質粒)，正反方向引物(稀釋后濃度為10 μM)各2 μL，DNA聚合酶0.1 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s， 30個循環，最后72 ℃延伸5 min。

1.4 重組體構建方法 用相應限制性內切酶雙酶切載體與目的片段一起等摩爾混合，經T4 DNA連接酶在16 ℃下過夜連接。將連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，涂布于含相應抗生素的LB培養基平板上，37 ℃倒置培養12～16 h，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，小量提取陽性克隆質粒，再進行質粒PCR、酶切鑒定和DNA測序，測序后與目的基因序列比對正確者為重組體。

2 結果

2.1 重組體p1305-U6-3XMSb質粒構建 EcoR I和Hind III雙酶切鑒定重組體質粒，經測序可知載體構建成功,構建示意圖及結果見圖1。

圖1 重組體p1305-U6-3XMSb構建圖A：重組體p1305-U6-3XMSb的構建示意圖。藍、紅、綠色3個矩形分別代表MSb1、MSb2、MSb3 3個短基因片段，突出部分為粘性末端，棕色橢圓為載體；B：重組體經酶切鑒定的電泳結果圖。 M.DNA Marker，1.重組質粒用EcoR I和Hind III雙酶切得到600bp片段，2.質粒p1305-U6雙酶切得到的450bp U6啟動子片段；C：3個串聯MSb測序峰圖，分別用3個括號標明Fig.1 Diagram of p1305-U6-3XMSb constructingA.Diagram of constructing p1305-U6-3XMSb, in which the blue, red and green rectangles represent MSb1, MSb2 and MSb3 segments respectively.Highlights is the sticky end.Brown elliptic is the plasmid; B.Agarose gel electrophoresis results of enzyme digestion for p1305-U6-3XMSb, in which M is DNA Marker,1 column is a recombinant plasmid cleaved by EcoRI and HindIII and 600bp segment, 2 column is the fragment of U6 promoter of 450 bp; C.The diagram of DNA sequencing for 3XMSb

2.2 重組體p1305-FokI:MS2:FokI的構建 以質粒pST1374為模板，PCR擴增目的基因FokI和FokI2，以質粒pUC-24MS2為模板，WMS2F和WMS2R為引物，擴增目的片段MS2。雙酶切鑒定重組子，經測序驗證載體構建成功，構建過程及結果見圖2。

圖2 重組體p1305-FokI:MS2:FokI構建圖A：重組體p1305-FokI:MS2:FokI的構建示意圖。藍、紅、綠色3個矩形分別代表FokI、MS2、FokI 3個編碼蛋白的基因片段，突出部分為粘性末端，棕色的橢圓代表載體；B、C：FokI和MS2基因的PCR擴增電泳結果圖。M.DNA Marker；1.基因片段，箭頭代表片段大小；D：重組體經酶切鑒定的電泳結果圖。1.重組質粒經NcoI和BstEII雙酶切得到1700bp的含3個蛋白基因的片段；E：3個串聯蛋白的測序峰圖，分別用大括號標明，因序列太長，中間用省略號代替Fig.2 Diagram of p1305-FokI:MS2:FokI constructingA:Diagram of constructing p1305:FokI:MS2:FokI, in which the blue, red and green rectangles represent FokI , MS2 and FokI segments respectively who encoded protein.Highlights is the sticky end.Brown elliptic is the plasmid;B,C:Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification for FokI and MS2.M is DNA Marker; 1 is gene fragments, arrows mean the fragment size;D:Agarose gel electrophoresis of enzyme digestion for p1305-FokI-MS2-FokI, 1 is a recombinant plasmid cleaved by NcoI and BstEII and 1700bp segment linked to FokI, MS2 and FokI; E.The diagram of DNA sequencing for FokI, MS2 and FokI, three tandem genes are depicted.Because the sequence is too long, use ellipses instead of in the middle

2.3 重組體pGR107-P0WA的構建 以pER8的cDNA為模板，分別以PLRV-P0F和POWA87R、P0WA87F和P0WA140R、P0WA140F和PLRV-P0R、PLRV-P0F和PLRV-P0R為引物，PCR擴增得大小約為283 bp、188 bp、370 bp 3個目的片段。用ClaⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定重組子pGR107-P0WA，得到750 bp目的片段。經測序并序列比對，一次性成功將P0蛋白序列中第87位和第140位的色氨酸(W)點突變為丙氨酸(A)，重組體的構建示意圖及結果見圖3。

圖3 重組體pGR107-P0WA構建圖A：重組體pGR107-P0WA的構建示意圖。黑色橫向箭頭為PCR引物；紅線為PCR片段；橢圓為質粒，*為突變氨基酸位點；B：PCR擴增的電泳結果圖。M.DNA Marker；1，2，3.基因片段，箭頭代表片段大小；C：重組體經酶切鑒定的電泳結果圖。M.DNA Markev; 1.重組質粒經CalI和SalI雙酶切得到的750bp片段；D：突變氨基酸位點的測序峰圖。1，2.PLRV-P0基因未突變前序列及峰圖，1劃橫線的位置是第87位色氨酸(W)，2是140位色氨酸位置；3、4.基因突變后序列及峰圖，劃橫線的位置分別是突變后的第87位和140位丙氨酸(A)。測序序列為反向互補鏈Fig.3 Diagram of pGR107-P0WA constructingA:Diagram of constructing pGR107-P0WA,in which black horizontal arrows represent PCR primers, red lines are PCR fragments, oval represents the plasmid,* is complementary sticky end;B.Agarose gel electrophoresis of PCR amplification, in which M is DNA Marker.1,2,3 are gene fragments, arrows mean the fragment size.C.Agarose gel electrophoresis results of enzyme digestion for pGR107-P0WA, 1 is a recombinant plasmid cleaved by Cal and SalI and 750bp segment; D.The diagram of DNA sequencing for pGR107-P0WA.1,2 are gene sequences of PLRV-P0 without mutation, in which 1 row horizontal position is 87th of tryptophan (W), and 2 is 140 bit position of tryptophan.3,4 are gene sequences with mutation, in which the row horizontal position is 87 and 140 of alanine (A) after mutation

3 討論

后基因組時代的功能基因組和蛋白質組學等研究需要克隆、鑒定大量未知基因的功能，近年來發展起來的合成或整合生物學研究也需要同時克隆和表達一組功能相關基因，而ZFN和TALEN等基因組編輯技術也需要串聯克隆多個DNA序列結合蛋白。除了利用重組方法克隆基因外，近年來開發了幾種多基因組裝技術，如Golden Gate、BioBricks等，其中Golden Gate技術是利用Type II類核酸內切酶，利用其酶的識別與切割序列分離的特性，經酶切割后可以形成各片段首-尾相互配對的粘性末端，如載體被改造成含有同一核酸內切酶位點，則可經同一種酶切割后再連接，該方法對于串聯克隆較多DNA片段時非常有效[19]，但此方法不能兼顧傳統載體上的常用Type II類核酸內切酶；BioBricks方法是利用2個同尾核酸內切酶實現有限片段(一次只能串聯2個片段)的連接及克隆[20]。

本文結合Golden Gate和BioBricks克隆方法的優點，同時兼顧傳統酶切-連接克隆技術和大部分實驗室已有的克隆載體，利用DNA洗牌技術，構建了一種簡便、高效的多基因克隆方法。實驗結果表明，這是一種簡便、通用、高效的克隆基因的方法，具有以下優點：

① 設計操作相對簡便。傳統方法在構建多片段DNA插入的載體時，每插入一個片段就需要一次連接、轉化及陽性克隆鑒定，操作步驟繁瑣，通常要構建多個中間載體，要經多次連接、轉化，增加了重組體鑒定時的工作量，費時又費力。本文結果表明，對于編碼FokI、MS2、FokI 3個蛋白基因和MS2 binding RNA小片段DNA，只要引入合適的首尾相連的酶切位點，就可以一次性克隆入目標載體，實現單個重組反應精確連接多個基因片段，將雙酶切-連接克隆簡化為單個重組反應，便于分子克隆技術標準化，可以實現大規模克隆，而不影響基因的表達，大大節省了時間，提高了工作效率；② 實現基因之間的無縫連接。如果用Type II S類核酸內切酶，利用其酶的識別與切割序列分離的特性，經酶切割后可以形成各片段首-尾相互配對的粘性末端，并且不含內切酶的識別序列，則可以實現基因之間或基因編碼蛋白與標簽蛋白之間的無縫連接，即最終克隆的基因無外源冗余氨基酸，所表達的蛋白質可以真實反應其性質；③ 可同時定點突變基因內部多個氨基酸位點。傳統構建氨基酸替換突變多用位點重組PCR方法，該方法通過設計重疊引物而引入欲突變位點的編碼堿基，并且產生一個突變位點需經二輪PCR，克隆、測序驗證后，在此基礎上再經同樣過程產生第2個突變位點，以此類推。過程非常繁瑣且耗費時間。本文利用DNA洗牌術，通過設計含有DNA片段間經酶切后的單鏈突出互補末端的引物，在基因片段內部一次性引入并克隆2個氨基酸替換突變，極大地簡化了實驗步驟。對于確定蛋白質結構域中的關鍵氨基酸、蛋白質分子進化等研究提供了一種有效的技術手段。

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(編校：吳茜)

One step cloning multiple genes using DNA shuffling

WANG Xiao-meng,MENG Xiang-chao,CAO Xue-song

(College of Life science, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

ObjectiveTo explore the application of DNA shuffling method in the field of proteomics or metabolomics.MethodsMultiple genes or DNA fragments were cloned into destination vector and mutations of two amino acid substitutions within the gene were obtained though DNA shuffling, and the constructed plasmids were verdified by PCR, enzyme digestion and sequencing methods.ResultsMultiple tandem genes of MSb1, MSb2, MSb3 encoding small RNAs into destination vector were successfully cloned and two TGG encoding tryptophan to GCG encoding alanine within the sequence of PLRV-P0 gene were mutated simultaneously. ConclusionThis approach can be utilized in genomics, multi-gene identification or multi-site mutagenesis and fusion proteins expression, which is precise, cost-effective and high efficacy.

DNA shuffling; gene; clone

國家自然科學基金(31370387)；山東省自然科學基金(ZR2011CM045)

王肖猛，女，碩士，研究方向：植物分子生物學，E-mail：973082527@qq.com。

Q81

A

1005-1678(2015)02-0005-05