糖皮質激素通過線粒體途徑誘導成骨細胞凋亡

趙碩，李成

(遼寧醫學院附屬第一醫院 質量控制辦公室，遼寧 錦州 121000)

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糖皮質激素通過線粒體途徑誘導成骨細胞凋亡

趙碩，李成Δ

(遼寧醫學院附屬第一醫院 質量控制辦公室，遼寧 錦州 121000)

目的 探索糖皮質激素誘導成骨細胞凋亡的內在分子機制，為臨床防治激素性股骨頭壞死提供實驗依據。方法 將MC3T3-E1細胞分為control group及3個實驗組，實驗組分別采用不同濃度地塞米松(1、10、100 μmol/L)干預24 h后，TUNEL法檢測細胞凋亡率，JC-1染色后流式細胞儀檢測線粒體跨膜電位，胞質線粒體蛋白分離提取后Western blot檢測線粒體Bax、Bcl-2及胞質內Cyt-C、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)表達。結果 隨Dex干預濃度的增加，成骨細胞凋亡率顯著性升高(F(3,28)=159.0，P=0.000)，JC-1陽性細胞率顯著性升高(F(3,28)=499.5，P=0.000)，線粒體內Bax(F(3,28)=17.4，P=0.000)、胞質內Cyt-C(F(3,28)=22.4，P=0.000)與AIF(F(3,28)=42.61，P=0.000)表達均顯著性上調。各實驗組以上指標與control group相比差異有統計學意(P<0.05)。但各組線粒體內Bcl-2表達無顯著性差異(F(3,28)=0.62，P=0.607)。結論 地塞米松通過上調線粒體內Bax表達，促使線粒體敏感性轉化孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)過度開放，經線粒體途徑誘導成骨細胞凋亡。

地塞米松；成骨細胞；凋亡

目前，糖皮質激素的使用已成為非創傷性股骨頭壞死的首要病因[1]，但其發病機制仍不清楚。近年來有學者研究發現，在激素性股骨頭壞死標本內存在著大量的成骨細胞及骨細胞凋亡，而在其他因素導致的股骨頭壞死標本中卻未發現這一現象[2]。其后動物實驗也證實大劑量糖皮質激素可引起成骨細胞及骨細胞活性改變，凋亡是激素性骨壞死的首要變化[3-4]。因此有學者提出，GC誘導的成骨細胞及骨細胞凋亡與激素性股骨頭壞死的發病機制密切相關，認為細胞凋亡是激素性股骨頭壞死發生、發展的細胞學基礎[5-6]。這一理論的提出為激素性股骨頭壞死的病因學研究開辟了新的方向，但其凋亡信號轉導通路目前尚未明確。

目前已知細胞凋亡的信號轉導通路至少有3條：線粒體通路、內質網通路和死亡受體通路，其中線粒體通路最為經典[7]。本研究通過對不同濃度地塞米松(dexamethasone,Dex)干預后成骨細胞凋亡率、線粒體跨膜電位及線粒體相關凋亡蛋白在細胞內表達與定位的研究，探索激素誘導成骨細胞凋亡的分子機制，為臨床防治激素性股骨頭壞死提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：MC3T3-E1成骨細胞株購自ATCC (ATCC CRL-2596，USA)。

1.1.2 試劑：DMEM培養基和胎牛血清購自Gibco，Dex和PBS購自Sigma,TUNEL試劑盒購自普洛麥格， JC-1試劑盒購自碧云天，胞質和線粒體蛋白提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，I抗兔抗鼠Bcl-2、Bax、AIF、Cyt-C單抗購自武漢博士德，II抗辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG購自北京中杉。

1.1.3 儀器：正置光學顯微鏡(CX31，OLYMPUS公司)，流式細胞儀(BD FACSVantage SE,美國BD公司)，CO2培養箱(HERAcell 150i,Thermo公司)，臺式高速離心機(TGL-10C，上海安亭科學儀器廠)，恒壓恒流電泳儀(HC360，北京市六一儀器廠)，SDS-PAGE垂直電泳槽(MP-8000，北京凱元信瑞生物科技有限公司)，掃描儀(Bio-5000，MICROTEK )，分光光度計(UV2550,日本SHIMODZU)，冷凍離心機(CT15RE，日本HITACHI)，漩渦振蕩器(VORTEX3000，德國WIGGENS)。

1.2 實驗分組 將對數生長期的MC3T3-E1細胞充分混勻、分散，調整細胞濃度為1×106個/mL，按0.5 mL/孔接種于24孔板。設置control group及3個實驗組，每組8孔，實驗組分別添加不同濃度Dex(1、10、100 μmol/L)0.5 mL于37 ℃培養箱中培養24 h。

1.3 TUNEL法檢測細胞凋亡 將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗2次,4%多聚甲醛固定20 min。PBS漂洗3次，3%H2O2室溫(15 ℃～25 ℃)封閉10 min；滴加100 μL TdT 酶反應液，37 ℃避光反應60 min，PBS漂洗后DAB溶液顯色，蘇木素常規染液復染，光鏡觀察。

1.4 JC-1檢測線粒體跨膜電位 細胞加藥處理后，常規消化，用PBS洗1次后，加入JC-1工作液(300 nmol/L)，37 ℃孵育30 min后，JC-1緩沖液洗滌3次，立即上流式細胞儀檢測，分析JC-1陽性率。

1.5 線粒體、胞質內蛋白分離提取 冷PBS洗滌細胞，細胞懸液中加入1 mL胞質提取Buffer，冰上均質，渦旋震蕩15 s,放置冰上15 min，離心，保存沉淀；取上清轉移至新冷離心管，4 ℃,12000 r/min離心30 min，上清移入新管，為胞質蛋白，-80 ℃冷凍保存；將之前沉淀加入0.1mL胞質提取Buffer，渦旋震蕩30 s，13000 r/min離心10 min，棄上清；在沉淀中加入0.1 mL的線粒體溶解Buffer，冰上放置30 min，渦旋振蕩30 s；4 ℃ 13000 r/min離心10 min，收集上清，為線粒體蛋白，-80°C冷凍保存。

1.6 Western blot BCA法檢測蛋白濃度，取30 μg上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜，5%脫脂牛奶+牛血清白蛋白4 ℃冰箱封閉過夜，加一抗(稀釋比例1:2000，)勻速搖床孵育3 h后漂洗，然后加入PBS稀釋的辣根過氧化物標記的二抗(稀釋比例1:20000 )，室溫反應1 h后漂洗，化學發光底物顯色，成像。通過計算與內參蛋白(GAPDH)比值確定目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 TUNEL法檢測成骨細胞凋亡率 結果顯示，control group細胞核藍染，少見凋亡細胞，而在Dex 1、10、100 μmol/L組中可見大量細胞核被染成棕褐色的凋亡細胞，且隨Dex干預濃度的增加成骨細胞凋亡率顯著性升高[Dex 1 μmol/L(14.2±1.8)%、10 μmol/L(22.8±2.7)%、Dex 100 μmol/L(29.5±3.8)%]，在Dex 100 μmol/L時達到峰值(F(3,28)=159.0，P=0.000)。各實驗組與control group[(3.7±0.5)%]相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 TUNEL法檢測細胞凋亡率 (n=8,×400)*P<0.05，**P<0.01，與control group比較Fig.1 Detect the apoptosis rate by the TUNEL way(n=8,×400)*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

2.2 JC-1染色后檢測線粒體跨膜電位 結果顯示，隨Dex干預濃度的增加JC-1陽性細胞率顯著性升高[1 μmol/L(12.5±1.1)%、10 μmol/L(18.7±1.2)%、100 μmol/L(27.2±1.7)%]，線粒體跨膜電位降低，在100 μmol/L時達到峰值(F(3,28)=499.5，P=0.000)。各實驗組與control group[(4.5±0.7)%]相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 JC-1染色檢測線粒體跨膜電位結果(n=8)*P<0.05，**P<0.01，與control group比較Fig.2 Results of mitochondrial transmembrane electric potential after JC-1 staining(n=8)*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

2.3 Western blot檢測線粒體內Bax、Bcl-2表達 線粒體蛋白分離提取后行Western blot檢測，結果顯示隨Dex干預濃度的增加線粒體內Bax表達顯著性上調[1 μmol/L(0.28±0.05)、10 μmol/L(0.37±0.08)、100 μmol/L(0.43±0.11)]，在100 μmol/L時達到峰值(F(3,28)=17.4，P=0.000)。各實驗組與control group[(0.18±0.04)]相比差異有統計學意(P<0.05)。各組線粒體內Bcl-2表達無顯著性差異[control group (0.48±0.09)、1 μmol/L(0.51±0.12)、10 μmol/L(0.44±0.11)、100 μmol/L(0.46±0.11)] (F(3,28)=0.62，P=0.607)。

圖3 Westen blot檢測線粒體內Bax、Bcl-2表達情況(n=8)*P<0.05，**P<0.01，與control group比較Fig.3 Expression of Bax and Bcl-2 in the mitochondria by Western blot(n=8)*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

2.4 Western blot檢測胞質內Cyt-C、AIF表達 胞質蛋白分離提取后行Western blot檢測，結果顯示隨Dex干預濃度的增加胞質內Cyt-C[control group (0.16±0.03)、1 μmol/L(0.34±0.08)、10 μmol/L(0.45±0.13)、100 μmol/L(0.58±0.15)] (F(3,28)=22.4，P=0.000)、AIF[control group (0.15±0.03)、1 μmol/L(0.36±0.09)、10 μmol/L(0.58±0.16)、100 μmol/L(0.78±0.15)] (F(3,28)=42.61，P=0.000)表達均顯著性上調，在100 μmol/L時達到峰值。各實驗組與control group比較差異有統計學意(P<0.05)。

圖4 Western blot檢測胞質內Cyt-C、AIF表達情況(n=8)*P<0.05，**P<0.01，與control group比較Fig.4 Expression of Cyt-C,AIF in the cytoplasm by Western blot(n=8)*P<0.05，**P<0.01，compared with control group

3 討論

以往研究表明，大劑量糖皮質激素可以誘導成骨細胞凋亡，且隨著劑量增加細胞凋亡率逐漸升高[3]，這一論斷在本研究中得到了驗證，但具體的凋亡信號轉導通路目前仍不明確。因此本研究通過檢測各組細胞線粒體跨膜電位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)及線粒體相關凋亡蛋白的表達，進一步探討激素誘發成骨細胞凋亡的內在分子機制。

線粒體膜通透性轉運孔(mitochondrial permeabimity transitionproe，MPTP) 是定位于線粒體內、外膜之間由多種蛋白組成的非選擇性復合通道，是線粒體內外信息的交流中樞，其開放狀態決定著線粒體的功能發揮，在生理情況下的周期性開放對維持ΔΨm及線粒體內穩態有重要作用。在各種凋亡信號刺激下MPTP不可逆的過度開放，將導致ΔΨm下降甚至消失，呼吸鏈解偶聯，線粒體基質滲透壓增高，促凋亡活性物質釋放入胞質，從而啟動細胞凋亡程序[8]。通過檢測ΔΨm可直觀地反映MPTP的開放狀態。本研究發現，隨著Dex干預濃度的增加，JC-1陽性細胞率顯著性升高，組間比較差異有統計學意義(P<0.05),這一結果說明Dex干預濃度的增加促進了MPTP過度開放，使△Ψm降低，Dex可以通過線粒體途徑誘導成骨細胞凋亡。

由于以往研究表明，MPTP過度開放是通過Bcl-2家族抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白相互作用實現的[9-11]，因此選擇Bcl-2家族中具有代表性的2個蛋白Bax、Bcl-2，通過對其在細胞內的表達與定位研究進一步探討Dex對 MPTP的調控機制。Bax與Bcl-2是一對研究較明確、作用完全相反的線粒體相關凋亡蛋白，2者比值決定細胞對凋亡信號的反應。Bax正常定位于胞質內，在凋亡信號的刺激下可由細胞質易位到線粒體外膜，構成跨線粒體外膜的孔增加膜通透性，導致ΔΨm降低和Cyt-C及AIF的外流[12-13]。Bcl-2在正常細胞內定位于線粒體外膜，具有穩定線粒體膜的功能,可以封閉Bax形成孔道的活性，不斷地將易位至線粒體的Bax重新移回細胞質內，從而阻止線粒體外膜透化[14]。Cyt-C與AIF均錨定于線粒體內膜，當MPTP過度開放時其由線粒體釋放進入細胞質，可通過caspase依賴/非依賴途徑誘導細胞凋亡[15-16]。

本研究中發現，隨Dex干預濃度的增加，線粒體內Bax及胞質內Cyt-C、AIF表達均顯著性上調(P<0.05)，而線粒體內BCL-2無明顯變化，這一結果提示Dex是通過促使Bax由胞質易位至線粒體，使線粒體內Bcl-2/Bax比值降低，導致線粒體膜透化、MPTP過度開放，從而促進了Cyt-C、AIF等凋亡活性物質外流進而誘導凋亡。這可能是Dex誘導成骨細胞凋亡的機制之一。

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(編校：王儼儼)

Glucocorticoid induced apoptosis in osteoblast via a mitochondria-mediated pathway

ZHAO Shuo，LI ChengΔ

(Quality Control Office,The Frist Hospital of Liaoning Medical Colleage, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo explore the molecular mechanism of osteoblast apoptosis mediated by glucocorticoid, provide experimental basis for clinical prevention and treatment of hormonal necrosis of femoral-head.MethodsThe MC3T3-E1 cells were divided into control group and three treatment group treated with different concentrations of dexamethasone (1, 10, 100 μmol/L) for 24 hours.The apoptosis rate detected by TUNEL, the mitochondrial transmembrane electric potential after JC-1 staining by flow cytometry, the expression of Bax, Bcl-2 in mitochondrion and Cyt-C, apoptosis inducing factor (AIF) in cytoplasm by Western blot.ResultsWith the increasing of Dex concentration, the rate of osteoblast apoptosis was significantly increased(F(3,28)=159.0，P=0.000), the positive cell rate of JC-1 stainning was significantly increased(F(3,28)=499.5，P=0.000), the expression of Bax(F(3,28)=17.4，P=0.000)in mitochondrion and Cyt-C(F(3,28)=22.4，P=0.000), AIF(F(3,28)=42.61，P=0.000)in cytoplasm were significantly increased.There were statistically significant difference of above indexes between control group and each experimental group(P<0.05).But there were no significant differences of Bcl-2 in mitochondrion among five groups(F(3,28)=0.62，P=0.607).ConclusionDexamethasone increases expression of Bax in mitochondrion, prompts mitochondrial permeability transition pore (MPTP) to be over-openning, induces apoptosis in osteoblast via a mitochondria- mediated pathway.

dexamethasone; osteoblasts; apoptosis

遼寧省自然科學基金(2013022061)

趙碩，女，碩士，主管護師，研究方向：骨壞死的臨床與基礎研究，E-mail:zhaoshuo1982@126.com；李成，通訊作者，男，醫學博士，副主任醫師，研究方向：骨壞死的臨床與基礎研究，E-mail:lichen19780101@163.com。

R681.1

A

1005-1678(2015)07-0035-04