MR干細胞標記在替莫唑胺干預腦膠質瘤血管生成及治療研究中的應用

陳偉志，楊重恒

(1.遼寧醫學院附屬第一醫院 放射科，遼寧 錦州 121001；2. 遼寧醫學院附屬第一醫院 口腔科，遼寧 錦州 121001)

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MR干細胞標記在替莫唑胺干預腦膠質瘤血管生成及治療研究中的應用

陳偉志1Δ，楊重恒2

(1.遼寧醫學院附屬第一醫院 放射科，遼寧 錦州 121001；2. 遼寧醫學院附屬第一醫院 口腔科，遼寧 錦州 121001)

目的 探究MR干細胞標記在替莫唑胺干預腦膠質瘤血管生成及治療中的作用。方法 通過C6膠質瘤細胞株靜脈注射建立大鼠腦膠質瘤的動物模型，采用MR干細胞標記技術以及免疫組化觀測腫瘤生長及新生血管的生成，對比影像學與免疫組化檢測結果，進行2者間的相關性分析。結果 本研究成功運用MR掃描示蹤SPIO-PLL共同標記的骨髓干細胞，動態檢測了腦膠質瘤模型大鼠腦內腫瘤血管生成情況。影像學與免疫組化相關性分析結果顯示，2者呈現良好的負相關性(P<0.05)。結論 SPIO對于骨髓干細胞的磁性標記標記和MR示蹤技術是活體動態觀察腦膠質瘤血管生成的有效手段。

MR；干細胞標記；腦膠質瘤；血管生成

近年來，惡性腫瘤的發病率及死亡率正呈逐年上升的趨勢嚴重威脅著人類健康，其中膠質瘤是腦部最常見、浸潤性最強的原發性腫瘤，其侵襲性的生長方式導致術后復發率高，治療效果不理想[1-2]。腫瘤的發展與血管的生成密不可分，無論原發性還是轉移性，腫瘤的持續生長都必須依賴于血管的新生，目前抗腫瘤血管生成是腫瘤治療的研究熱點之一，監測腫瘤的血管新生情況也成為有效的抗腫瘤治療評價指標[3-4]。磁性標記骨髓干細胞能夠直接顯示腫瘤的新生血管，評價抗血管生成的治療效果，使活體檢測腫瘤的新生血管及抗血管生成治療效果成為可能[5-6]。本研究采用超順磁氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)及聚左旋賴氨酸(PLL)進行大鼠腦膠質瘤的干細胞標記及MR示蹤，觀察腫瘤的血管生成及治療情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞：1月齡雄性SPF級SD大鼠5只，體質量(100±12)g；2月齡雄性SPF級SD大鼠50只，體質量(200±25)g(大連醫科大學實驗動物中心，合格證號：2014-7A004)；膠質瘤細胞為C6膠質瘤細胞株。

1.1.2 藥品與試劑：胎牛血清(美國Hyclone公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；胰酶(Shanghai生物工程技術服務有限公司)；替莫唑胺(江蘇天士力帝益藥業有限公司)；聚左旋賴氨酸(Sigma公司)；超順磁氧化鐵(德國拜爾公司)。

1.1.3 實驗儀器：HH.CP-01型CO2培養箱(上海凱朗儀器設備廠)；CKX41倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)；ACB-A超凈工作臺(新加坡藝思高科技有限公司)；1.5 T磁共振成像系統(Sonata Siemens公司)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓干細胞分離及培養：取體重指數為(100±12)g的大鼠，頸椎脫臼處死后，取動物的脛骨及股骨，用不加血清的DMEM培養基沖洗骨髓腔，獲得的細胞懸液2000 rpm離心 3 min， 棄去上清，沉淀中加入含有10%胎牛血清的DMEM培養基，反復吹打制成細胞懸液并計數，以2×107個/mL接種入含10%胎牛血清的DMEM培養基內，置于CO2培養箱中，37 ℃，5%CO2的條件下培養，每2 d換液1次，每周傳代1次，傳代至第4代時-20 ℃凍存備用。

1.2.2 骨髓干細胞的SPIO-PLL共同標記：將20 g/mL的磁性標記物SPIO與0.4 μg/mL的PLL混合，并加入到含有骨髓干細胞DMEM培養基中，37 ℃條件下孵育24 h。

1.2.3 大鼠腦膠質瘤模型的建立：采用立體腦定位儀對大鼠進行固定，于冠狀縫向前1 mm，中線旁開3 mm，深度5 mm處用微涼注射器注射C6膠質瘤細胞懸液5 μL，速度為1 μL/min。

1.2.4 SPIO-PLL共同標記的骨髓干細胞的移植：注射C6膠質瘤細胞2周后，對于大鼠進行MR掃描觀察腫瘤生長情況，對50只大鼠進行造模，選取造模成功的40只進行試驗，尾靜脈注射SPIO-PLL共同標記的骨髓干細胞懸液0.5 mL。

1.2.5 實驗動物分組及給藥：將40只已標記的模型大鼠隨機分成2組，每組20只，分別為替莫唑胺組和對照組，替莫唑胺組按照1 mg/kg給予替莫唑胺，1次/周，連續給藥2周，對照組給予等量生理鹽水。

1.2.6 MR示蹤腦膠質瘤內SPIO-PLL共同標記的骨髓干細胞分析方法：分別于標記的骨髓干細胞的移植前1 d，給藥前 1 d 以及給藥2周后1、2 d進行MR檢查，項目包括T1 WI，T2WI以及T2*map。T1 WI掃描：TE=400 ms，TR=9.5 ms；T2WI掃描：TE=3000 ms，TR=45 ms；T2*map掃描TE=3000 ms，TR=2.5-37 ms；采用常規橫斷位掃描層厚度1.0 mm，層間距0.0 mm，層數10，FOV=50-80 mm。觀察和分析T1 WI ，T2WI以及T2*map圖像上大鼠腦膠質瘤的形態，信號特征，邊緣等情況，計算腫瘤體積。

1.2.7 MR擴散加權成像掃描分析方法：采用SE-EPI的序列中10個擴散敏感度的b值進行加權擴散成像，采用橫斷位掃描。TE=1800 ms，TR=85 ms，層厚度1.0 mm，層間距0.0 mm，層數10，FOV=70 mm。將不同b值的DWI圖像輸入Biomap軟件中進行擬合，得到10個不同b值的表觀擴散系數(ADC10b)，對照組和替莫唑胺組分別于治療前、治療后5 d以及治療后10d隨機選取12、14、14只大鼠進行ADC10b擬合。

1.2.8 免疫組化檢測：2組分別于治療后5 d、10 d各14只大鼠經MR掃描后處死相應組別大鼠，取出瘤體并用10%甲醛固定，經石蠟包切片、脫蠟至水，治療后5 d、10 d各14個的樣本隨機平均分成兩組分別進行后進行微血管密度(MVD)計數和血管內皮生長因子(VEGF)表達的檢測。經過石蠟包埋，切片，脫蠟至水，熱修復，3%過氧化氫的PBS封閉內源性過氧化物酶，分別滴加一抗CD34(1:100)、一抗VEGF(1:100)，4 ℃過夜，沖洗，滴加二抗20 min，沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，PBS返藍，脫水，封片。2組分別于治療后5、10 d經MR掃描后處死相應組別大鼠，取出瘤體并用10%甲醛固定，經石蠟包切片、脫蠟至水后進行微血管密度(MVD)計數和血管內皮生長因子(VEGF)表達的檢測。

1.2.9 ADC10b擬合結果與免疫組化結果相關性分析:分別將2組MR擴散加權成像掃描中不同b值擬合出的ADC10b與免疫組化檢測中獲得的MVD計數及VEGF計分進行Pearson線性相關性的分析。

2 結果

2.1 常規MR示蹤檢測結果 在注射SPIO-PLL共同標記的骨髓干細胞前的模型大鼠的MR掃描結果可見大鼠腦右側基底節區域顯示T1WI信號稍低，T2WI信號稍高，腫瘤瘤體區域強化，腫瘤區域T2*map可見線狀針道信號，而腫瘤組織的T2*map信號未見明顯異常。將 T2WI 數據輸入 Biomap 軟件內進行擬合，獲得腫瘤組織的體積, 所有模型大鼠腫瘤的體積分布在50 mm3-100 mm3之間。劃取3次最大感興趣區，取其平均值計算腫瘤體積注射SPIO-PLL共同標記的骨髓干細胞后的模型大鼠的MR掃描結果可見，T1WI和T2WI在腫瘤區域周圍均有低信號出現，但信號有逐漸消散的趨勢，表明被標記的骨髓干細胞開始遷移和分化，由此可以證實SPIO-PLL標記的骨髓干細胞向瘤體遷移的進程可以被MR所示蹤。在給予抗腫瘤藥物治療后可見T2WI上出現一部分腫瘤信號不均勻，呈現斑塊狀的高信號液化壞死區域。見圖1。

圖1 治療前后模型大鼠常規MR掃描(n=3)Fig.1 Conventional MR scan in the model rats pre- and post-treatment(n=3)

2.2 ADC10b擬合 治療前替莫唑胺組和對照組的ADC10b值沒有顯著性差異，ADC圖像顯示腫瘤區呈現低信號，腫瘤邊界清晰。治療后5d和10d時，替莫唑胺組的ADC10b均高于對照組(P<0.05)。ADC圖像上顯示信號不均勻的現象，并可見斑塊狀液化壞死區域。見表1、圖2。

表1 2組腦膠質瘤模型大鼠治療前后不同時段ADC10b值的測量結果±s)Tab.1 The measurement results of different time ADC10b value of the two groups pre-and post-treatment of brain glioma ±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

圖2 治療前后ADC10b圖Fig.2 ADC10b figure pre-and post-treatment

2.3 免疫組化檢測結果 替莫唑胺組在治療后5 d和10 d，MVD計數值低于對照組(P<0.05)。在VEGF計分檢測中，替莫唑胺組在治療后5 d和10 d，VEGF計分值低于對照組(P<0.05)。見表2、表3、圖3、圖4。

表2 2組腦膠質瘤模型大鼠治療后不同時段MVD計數的測定結果±s)Tab.2 The determination results of MVD counting of rat brain glioma model after treatment in different periods of two ±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

表3 2組腦膠質瘤模型大鼠治療后不同時段VEGF計分的 測定結果Tab.3 Determination results of VEGF score of rat brain glioma model after treatment in different periods of two ±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

圖3 2組腦膠質瘤模型大鼠治療后不同時段MVD結果圖A：替莫唑胺組治療后5 d；B：替莫唑胺組治療后10 d；C：對照組治療后5 d；D：對照組治療后10 dFig.3 MVD results of brain glioma model between two groups atdifferent time post-treatmentA: temozolomide group 5 d after post-treatment;B: temozolomide group 10 d after post-treatment;C: control group 5 d after post-treatment;D: control group 10 d after post-treatment

圖4 2組腦膠質瘤模型大鼠治療后不同時段VEGF結果圖A：替莫唑胺組治療后5 d；B：替莫唑胺組治療后10 d；C：對照組治療后5 d；D：對照組治療后10 dFig.4 VEGF results of brain glioma model between two groups atdifferent time post-treatment A: temozolomide group 5 d after post-treatment;B: temozolomide group 10 dafter post-treatment;C: control group 5 d after post-treatment;D: control group 10 d after post-treatment

2.4 ADC10b擬合結果與免疫組化結果相關性分析 分別將2組MR擴散加權成像掃描中不同b值擬合出的ADC10b與免疫組化檢測中獲得的MVD計數及VEGF計分進行Pearson線性相關性的分析。結果顯示，ADC10b與免疫組化檢測中獲得的MVD計數(r=-0.647，P=0.000)及VEGF計分(r=-0.571，P=0.000)均顯示出良好的負相關性，結果具有統計學意義(P<0.05)。這充分說明了采用MR示蹤SPIO-PLL共同標記的骨髓干細胞方法進行腦膠質瘤血管生成的檢測是可行的。

3 討論

腫瘤的新生血管在腫瘤的生長與轉移中具有十分重要的作用，它不僅為腫瘤的生長提供血液等營養物質，更為腫瘤細胞的浸潤和轉移提供通道[7]。病理學中常采用MVD來評判腫瘤的血管生成情況。CD34是血管內皮細胞特異性標記物之一，能夠特異性的表達于血管內皮細胞，MVD可以借助于CD34特異性表達從而直接定量的反映腫瘤組織的血管生成情況[8-9]。血管的新生依賴于多種細胞因子的調控，其中血管內皮生長因子(VEGF)是目前已知的最強的血管滲透劑，可以增加微血管的滲透性，促進血管內皮細胞增殖、遷移，誘導毛細血管管腔的形成，達到促進血管生成的作用。VEGF體內促進血管內發生，體外促進內皮細胞增生，VEGF不僅對血管內皮細胞有趨化和生長刺激作用，而且誘導產生相關的蛋白產物參于血管外基質的降解，使VEGF從基質中釋放，參與血管的形成[10-12]。

雖然MVD和VEGF等指標均能有效地反映機體內腫瘤組織的血管生成情況，但在臨床應用中存在諸多限制，不能進行實時、動態、可重復的操作和觀察。隨著分子影像學技術的發展，新的影像學技術能顯示早期的細胞代謝及血流灌注等相關信息，其中MR以其安全無輻射、可定量等優勢在觀察機體內腫瘤的變化和發展方面越來越受到關注[13-14]。在體外使用SPIO對目標干細胞進行標記，通過轉染劑的修飾進一步提高有效磁標記率，利用磁共振成像追蹤干細胞的增殖、移行等情況來判斷腫瘤組織的變化，從而達到實時、高效、可重復的觀察目的，有利于臨床的治療與研究的開展[15]。

同時，本研究采用相關性分析，進一步驗證了MR示蹤SPIO-PLL共同標記的骨髓干細胞方法進行腦膠質瘤血管生成的檢測的可行性。本研究中選取的ADC10b與細胞增值的情況密切相關，可以動態的反映腫瘤區域血管增值的情況，實驗結果表明其變化與免疫組化的結果呈現良好的負相關性，且在可操作性、數據采集的連續性以及患者依從性方面較免疫組化方法更加具有優勢。隨著該項技術在實驗和臨床實踐中的不斷進步，它將會得到越來越廣泛的應用。

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(編校：王冬梅)

Application of MR stem cell markers in research of temozolomide intervention gliomas angiogenesis and therapy

CHEN Wei-zhi1Δ, YANG Zhong-heng2

(1.Department of Radiology, First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 2. Department of Stomatology, First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo explore the role of MR stem cell markers in temozolomide intervention gliomas angiogenesis and therapy.MethodsC6 glioma cells were intravenously injected in glioma model rat. MR stem cell markers and immunohistochemistry were used to observe the tumor growth and angiogenesis. Correlation of contrast imaging and immunohistochemistry results were studied.ResultsIn this study, MR scanning was successfully used to trace the SPIO-PLL marked bone marrow stem cells, dynamic testing of angiogenesis in rat brain glioma tumor. Correlation analysis of imaging and immunohistochemical showed that they had a good negative correlation (P<0.05).ConclusionSPIO magnetic markers for bone marrow stem cells and MR tracing technique is an effective means of dynamic observation in vivo glioma angiogenesis.

MR; stem cell markers; glioma; angiogenesis

國家自然科學基金計劃(2013022027)

陳偉志，通信作者，男，碩士，主治醫師，研究方向：神經影像診斷，E-mail:lnchenwwizhi@163.com。

R445

A

1005-1678(2015)12-0009-04