HPLC法測(cè)定青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯的含量

蔣紅艷,曾雪,陳義娟

(重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校 藥學(xué)院，重慶 400030)

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HPLC法測(cè)定青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯的含量

蔣紅艷,曾雪,陳義娟

(重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校 藥學(xué)院，重慶 400030)

目的 建立梯度洗脫HPLC 法測(cè)定青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯含量。方法 色譜柱為Wondasil C18-WR，流動(dòng)相采用乙腈-磷酸水溶液(pH=3)的二元梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃。結(jié)果 青蒿琥酯在0.2～3.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9997)，平均加樣回收率為99.0%(RSD=1.35%，n=6)。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、靈敏，重現(xiàn)性好，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

梯度洗脫；HPLC；青蒿琥酯阿莫地喹片；青蒿琥酯

青蒿琥酯阿莫地喹片是由青蒿琥酯和阿莫地喹組成的復(fù)方制劑，臨床主要用于治療瘧疾急性發(fā)作，控制瘧疾癥狀。其中青蒿琥酯為青蒿素的衍生物，青蒿琥酯對(duì)瘧原蟲紅內(nèi)期有強(qiáng)大且快速的殺滅作用，快速清除瘧原蟲, 迅速控制瘧疾癥狀。青蒿琥酯在堿性條件下穩(wěn)定性更好，殺滅瘧原蟲的作用更強(qiáng), 對(duì)耐藥惡性瘧疾也有很好的治療作用。青蒿琥酯單藥治療瘧疾作用顯著，聯(lián)合治療瘧疾效果更佳[1-2]。青蒿琥酯阿莫地喹片是臨床常用的復(fù)方制劑，其中青蒿琥酯可延緩阿莫地喹的耐藥性，而阿莫地喹能降低青蒿琥酯治療后的瘧疾復(fù)發(fā)率，2者取長(zhǎng)補(bǔ)短，提高抗瘧疾效果[3-4]。已有文獻(xiàn)報(bào)道青蒿琥酯的含量檢測(cè)方法有紫外分光光度法[5]、高效液相色譜法[6-10]、高效液相色譜-ELSD 法[11]、高效薄層色譜法[12]等，都取得了較為滿意的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫HPLC法測(cè)定青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯的含量，以期找出一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的測(cè)定青蒿琥酯含量的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 LC-15C島津液相色譜儀，SPD-15C檢測(cè)器，Lcsolution 15C工作站(日本島津)；色譜柱(Wondasil C18-WR，5 μm，日本島津)；FA2104S電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；UV-6100PC雙光束紫外/可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)有限公司)。

1.2 藥品與試劑 青蒿琥酯對(duì)照品(純度為99.7%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100200-201003)；青蒿琥酯阿莫地喹片(桂林南藥股份有限公司，批號(hào)為SH140303，SH140601，SH140801)；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 青蒿琥酯對(duì)照品溶液的制備：精密稱取青蒿琥酯對(duì)照品32.0 mg， 置于10 mL量瓶中, 加入甲醇使其溶解, 稀釋至刻度, 搖勻, 制成每1 mL含3.2 mg的對(duì)照品溶液。

1.3.2 青蒿琥酯阿莫地喹片供試品溶液的制備：取10片藥品，稱定總量后，將片劑放置于研缽中研磨成細(xì)粉，精密稱取粉末(相當(dāng)于50 mg青蒿琥酯)，置于25 mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，超聲30 min，用定量濾紙過濾，濾液再以0.22 μm 微孔濾膜濾過，精密量取續(xù)濾液2.5 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻得供試品溶液。

1.3.3 青蒿琥酯的含量測(cè)定

① 光譜掃描：取上述1.3.1對(duì)照品溶液1 mL，加甲醇并稀釋至100 mL，搖勻。在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，尋找青蒿琥酯最佳吸收波長(zhǎng)。

② 色譜條件：流動(dòng)性：乙腈-磷酸水溶液(pH=3)為有機(jī)相和水相；波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1 mL/min。采用二元梯度洗脫，梯度洗脫程序如下：0～5 min，26%～39%乙腈；6～10 min，40%～54%乙腈；11～30 min，55%～80%乙腈；31～40 min，81%～100%乙腈；41～45 min，100%～26%乙腈。理論塔板數(shù)(按青蒿琥酯計(jì)算)不小于30 000 。

③ 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將青蒿琥酯對(duì)照品以甲醇稀釋分別得0.2 、0.4 、0.8、1.6和3.2 mg/mL對(duì)照品溶液, 依次進(jìn)樣20 μL, 記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分析計(jì)算青蒿琥酯回歸方程。

④ 重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批青蒿琥酯阿莫地喹片樣品(批號(hào)為SH140303)，按照1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液共6份，依法測(cè)定,記錄峰面積。

⑤ 穩(wěn)定性試驗(yàn)：稱取同一批青蒿琥酯阿莫地喹片樣品(批號(hào)為SH140303)，按照1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液, 在24 h內(nèi), 間隔4 h進(jìn)樣1次, 依法測(cè)定, 記錄峰面積。

⑥ 精密度試驗(yàn)：稱取同一批青蒿琥酯阿莫地喹片樣品(批號(hào)為SH140601)，按照1.3.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液, 連續(xù)進(jìn)樣6次, 每次20 μL, 依法測(cè)定, 記錄峰面積。

⑦ 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取6 份已知青蒿琥酯含量的樣品(批號(hào)為SH140601), 按1.3.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法配制樣品, 分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液, 用甲醇定容至刻度, 搖勻, 依次進(jìn)樣20 μL, 測(cè)定峰面積, 計(jì)算回收率。

⑧ 檢測(cè)限和定量限試驗(yàn)：取0.2 mg/mL青蒿琥酯對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣，并以流動(dòng)相為空白溶液進(jìn)樣，測(cè)定，記錄色譜圖。按照信噪比為3:1計(jì)算檢測(cè)限，按照信噪比為10:1計(jì)算定量限。

⑨ 青蒿琥酯含量測(cè)定：取3批樣品(批號(hào)為SH140303，SH140601，SH140801)， 按照1.3.2制備方法制備供試品溶液， 取20 μL 進(jìn)樣，測(cè)定青蒿琥酯含量。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：在190～400 nm范圍內(nèi)全波長(zhǎng)掃描圖譜見圖1，結(jié)果顯示青蒿琥酯在203 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但為了避免甲醇、乙腈等溶劑末端吸收的影響，故選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 紫外波長(zhǎng)掃描圖譜Fig.1 Scanning spectra of UV wavelength

2.1.2 青蒿琥酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線：以青蒿琥酯峰面積(Y)對(duì)青蒿琥酯濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=770638X-6909.9，r=0 .9997，線性范圍為0.2～3.2 mg/mL。見圖2。

圖2 青蒿琥酯標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of artesunate

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)：按照1.3.3項(xiàng)下的④進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定峰面積的RSD為1.82%(n=6)，結(jié)果表明該方法重復(fù)性好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：按照1.3.3項(xiàng)下的⑤項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定峰面積的RSD 為1.23 %(n=6), 結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 精密度試驗(yàn)：按照1.3.3項(xiàng)下的⑥項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定峰面積的RSD 為1.87 %(n=6)，表明該方法精密度較好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)：按照1.3.3項(xiàng)下的⑦項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定峰面積, 計(jì)算回收率，平均回收率為99.0%，RSD 為1.35%。見表1。

表1 青蒿琥酯加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Recovery of artesunate (n=6)

2.1.7 檢測(cè)限和定量限：按照1.3.3項(xiàng)下的⑧項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法的檢測(cè)限為0.25 μg，定量限為0.83 μg。

2.1.8 含量測(cè)定：分別取青蒿琥酯對(duì)照品溶液及青蒿琥酯阿莫地喹片供試品溶液各20 μL, 注入高效液相色譜儀中并記錄色譜圖，見圖3、圖4。按照外標(biāo)法計(jì)算青蒿琥酯的含量。3批供試品(批號(hào): SH140303，SH140601，SH140801)的含量分別為99.2 %、98.8%、100.5%。

圖3 青蒿琥酯對(duì)照品色譜圖Fig.3 HPLC of artesunate reference substance

圖4 青蒿琥酯供試品色譜圖Fig.4 HPLC of artesunate test solution

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 有文獻(xiàn)報(bào)道青蒿琥酯的檢測(cè)波長(zhǎng)有205 nm[6]、237 nm[13-14]、289 nm[5]等，本實(shí)驗(yàn)對(duì)青蒿琥酯對(duì)照品溶液在190～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在203 nm處有最大吸收。為了保證檢測(cè)的靈敏度, 同時(shí)避免甲醇、乙腈等溶劑末端吸收的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 在實(shí)驗(yàn)過程中分別考察了流動(dòng)相為乙腈-水、甲醇-水、甲醇-Na2HPO4-NaH2PO4(pH=3)、乙腈-磷酸水溶液(pH=3)等4 種流動(dòng)相對(duì)本品的洗脫實(shí)驗(yàn), 結(jié)果表明在流動(dòng)相乙腈-水、甲醇-水、甲醇-Na2HPO4-NaH2PO4(pH=3)中，峰形較差，拖尾現(xiàn)象較明顯；而在流動(dòng)相乙腈-磷酸水溶液(pH=3)中的保留時(shí)間適中，拖尾因子和對(duì)稱因子均符合要求。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-磷酸水溶液(pH=3)作為流動(dòng)相，得到了較好的分離效果。

3.3 洗脫梯度的確定 采用乙腈為流動(dòng)相A，磷酸水溶液為流動(dòng)相B，不同時(shí)間更換不同的比例，青蒿琥酯檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，最后確定本實(shí)驗(yàn)洗脫程序。

梯度洗脫是使溶劑強(qiáng)度在色譜過程中逐漸增加，在一個(gè)分析周期中按照一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比, 從而使復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較多的組分達(dá)到很好的分離效果[15]。梯度洗脫HPLC可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，但由于是多種溶劑混合，且組成不斷變化，有可能引起基線漂移和降低重現(xiàn)性[16]。因此梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證獲得良好的重現(xiàn)性。

本實(shí)驗(yàn)通過考察波長(zhǎng)、流動(dòng)相、流動(dòng)相的梯度以及流速對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，最后確定流動(dòng)相為乙腈-磷酸水溶液(pH=3)，采用二元梯度洗脫，流速為1 mL/min，保留時(shí)間為16 min，該方法靈敏度高，保留時(shí)間適中，且峰形較好，得到了較好的分離效果。本文采用梯度洗脫HPLC法對(duì)青蒿琥酯阿莫地喹片中青蒿琥酯進(jìn)行了含量測(cè)定。該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可以用于青蒿琥酯的質(zhì)量控制。

[1] 牛艷紅，王玉斌.青蒿琥酯治療維和人員瘧疾109例療效觀察[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，10(8)：764-765.

[2] 李佳，吳蘭鷗，楊照青.青蒿素類抗瘧藥藥效的比較及聯(lián)合用藥[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2009，9(1)：157-159、195.

[3] 劉宗磊，楊恒林.青蒿素類藥物研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2014，9(1)：97-99.

[4] Santwana Kar，Santosh Kar，朱寶益.控制瘧疾，藥物開發(fā)需先行[J].中國(guó)處方藥，2010，7：52-53.

[5] 黃君麗，詹利之，林燕芳，等.UV法測(cè)定青蒿琥酯軟膠囊中青蒿琥酯的含量[J].中藥材，2012，35(10)：1693-1695.

[6] 張洪，閆士君，張福明.高效液相色譜法測(cè)定青蒿琥酯的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32(1)：65-67.

[7] 劉向紅，何虹，盧日剛，等.高效液相色譜法測(cè)定青蒿琥酯中的有關(guān)物質(zhì)[J].中南藥學(xué)，2010，8(9)：683-686.

[8] 岳莉.青蒿琥酯片含量測(cè)定的方法學(xué)研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27(5)：1017-1020.

[9] 田兆紅.HPLC法測(cè)定青蒿琥酯片的含量[J].醫(yī)學(xué)信息，2007，20(9)：1655-1656.

[10] 夏錚錚，范琦，楊成鋼，等.HPLC法測(cè)定青蒿琥酯及其片劑的含量[J].藥物分析雜志，2006，26(5)：656-658.

[11] 申薇薇，王銳利，吳婧，等.高效液相-柱后衍生化法測(cè)定青蒿琥酯含量[J].中國(guó)藥物與臨床，2008，8(11)；855-857.

[12] Agarwal SP,Ali A,Ahuja S.HPTLC determination of artesunate as bulk drug and in pharmaceutical formulations[J].Ind J Pharm Sci,2007,69:841-844.

[13] 李均亮，李冰，周緒正，等.青蒿琥酯納米乳中青蒿琥酯的分光光度法和HPLC法分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51(8)；1678-1680.

[14] 李均亮.青蒿琥酯納米乳的制備及評(píng)價(jià)[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[15] 宋潔瑾，陳濤，李進(jìn).梯度洗脫方法在中藥指紋圖譜中的應(yīng)用[J].天津藥學(xué)，2007，19(6)；70-72.

[16] 孫玉琦，肖小河，代春美，等.梯度洗脫HPLC法測(cè)定抗病毒泡騰片中連翹苷的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(3)：215-217.

(編校：王冬梅)

Determination of artesunate in artesunate and amodiaquine hydrochloride tablets by HPLC

JIANG Hong-yan,ZENG Xue,CHEN Yi-juan

(College of Pharmacy, Chongqing Medical and Pharmaceutical College, Chongqing 400030, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of artesunate in artesunate and amodiaquine hydrochloride tablets.MethodsWondaSil C18-WR column was used with mobile phase consisted of acetonitrile:phosphoric acid aqueous solution(adjust pH to 3，gradient elution);wavelength was 210 nm; flow rate was 1 mL/min and the column temperature was 30 ℃.ResultsThe standard curve was linear in the range of 0.2～3.2 mg/mL(r=0.9997), average recoveries were 99.0%(RSD=1.35%,n=6).ConclusionThe method is accurate and sensitive, and it can be used to control the quality of artesunate and amodiaquine hydrochloride tablets.

gradient elution;HPLC;artesunate and amodiaquine hydrochloride tablets;artesunate

重慶市教委科研項(xiàng)目(KJ1402601)；重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(2012-1-093)；重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(2012-2-17)

蔣紅艷，女，碩士，副教授，研究方向：從事中藥藥理的研究，E-mail：jianghy200568@126.com。

R927

A

1005-1678(2015)03-0166-03