烏頭堿對室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的影響研究

余成

(海南省人民醫院 心臟外科，海南 海口 570311)

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烏頭堿對室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的影響研究

余成

(海南省人民醫院 心臟外科，海南 海口 570311)

目的 探究烏頭堿對室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)的影響。方法 選取80只室間隔缺損模型大鼠，隨機分為2組，其中實驗組40只經尾靜脈注射，給予0.05 mg/kg烏頭堿，連續7 d；對照組40只予等量生理鹽水經尾靜脈注射，連續7 d。實驗結束后，各組大鼠腹主動脈取血，分別采用Western blot法和ELISA法測定血清中鋅指蛋白41和SPARC，表達并進行比較。結果 Western blot結果表明，2組血清樣本中，鋅指蛋白41和SPARC均有所表達，但實驗組鋅指蛋白41和SPARC相對表達均明顯低于對照組(P<0.05)；ELISA結果表明，實驗組鋅指蛋白41和SPARC的濃度均明顯低于對照組(P<0.05)。結論 烏頭堿能夠明顯降低室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和SPARC的表達水平。

烏頭堿；室間隔缺損；鋅指蛋白41；半胱氨酸的酸性分泌蛋白

室間隔缺損(ventricular septal defect，VSD)是由于遺傳因素、環境因素等導致胚胎的室間隔發育不完全而引起的一種先天性心臟疾病[1]。本病臨床表現為氣促、呼吸困難、反復發生的肺部感染、喂養困難、乏力、多汗、紫紺等，嚴重者可出現心力衰竭，臨床表現的嚴重程度與缺損大小有關[2]。本病多發于嬰幼兒，據2007年九屆中國南方國際心血管病學術會議調查統計[3]，我國VSD患者的發病率為0.3%，占到小兒先天性心臟病的50%左右，并有逐年上升趨勢。隨著分子生物學技術的發展，本病人們更加重視疾病防治及預后，現代醫學多試圖從蛋白質表達與調控方面探索疾病診斷治療的新思路[4]。研究發現[5]，目前室間隔缺損多采取手術治療，術后多配合烏頭堿等藥物增強心肌收縮力，但關于烏頭堿對VSD的作用研究較少。本研究旨在通過觀察烏頭堿對各組室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41、半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇Jcl:ICR的懷孕母鼠，在妊娠8.5 d給予70 mg/kg視黃酸，待產崽后通過動物B超儀器，篩選室間隔缺損模型大鼠80只(由中國醫科大學動物實驗室提供，合格證號：遼H00132)，體質量(280±30)g。大鼠均采用標準飼料喂養，自由進食，室溫控制在19 ℃～23 ℃，濕度控制在55%～60%，本實驗遵循《實驗動物保護條例》，符合3R原則。

1. 2 主要試劑和儀器 烏頭注射液(菏澤步長制藥有限公司，國藥準字Z37021104)；大鼠鋅指蛋白41抗體、大鼠鋅指蛋白41 ELISA試劑盒、大鼠SPARC抗體、大鼠SPARC ELISA試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司)；PBS漂洗緩沖液(BOSTER公司)；Western封閉液、專用一抗二抗稀釋液、DyLight 680標記羊抗鼠IgG二抗(上海雙螺旋生物科技有限公司)；蛋白電泳儀、離心機(美國貝克曼庫爾特公司)；Spectra Max M5酶標儀(美國Molecular Devices)。

1.3 分組給藥及標本采集 將室間隔缺損模型大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組40只。實驗組大鼠經尾靜脈注射予0.05 mg/kg烏頭堿，對照組大鼠給予等量的0.9%氯化鈉注射液，均連續注射7d；實驗前后分別抽取大鼠的腹腔動脈血10 mL，靜置于4 ℃冰箱，1 h后3000 r/min離心，取上清液，置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.4 Western blot法測定鋅指蛋白41和SPARC含量 在保存的各血清中加入TBS液進行稀釋(10×)；加入上樣緩沖液，分別于沸水、冰塊中放置5 min，之后離心1 min；將各樣本加入上樣孔中；將電泳槽電壓設置在80 V，進行電泳至分離膠染色，電壓改為120 V，至染色區域距玻璃板1 cm停止；利用轉膜儀將凝膠染色轉至經甲醇浸泡過的PVDF膜上；室溫下，將PVDF膜置入含有Western blot抗體的孵育30 min后封閉，2 h后用TBST沖洗5 min，反復進行3次；將封閉過的PVDF膜置入稀釋后的大鼠鋅指蛋白41抗體溶液(大鼠SPARC抗體溶液，稀釋1000倍)中，4 ℃搖床過夜；將PVDF膜置入稀釋后的DyLight 680 標記羊抗鼠IgG二抗(稀釋1000倍)溶液中2 h；清洗后利用紅外激光成像系統掃描，觀察蛋白的表達量[6]。

1.5 ELISA法測定鋅指蛋白41和SPARC含量 鋅指蛋白41和SPARC含量測定嚴格按照 ELISA試劑盒說明操作。

2 結果

2.1 Western blot法檢測2組大鼠血清鋅指蛋白41和SPARC表達 Western blot結果表明，實驗組鋅指蛋白41和SPARC表達水平均明顯低于對照組(P<0.05)，見圖1、圖2。

圖1 Western blot 測定2組鋅指蛋白41和SPARC的表達1-4：實驗組；5-8：對照組Fig.1 Western blot results of zinc finger protein 41 and SPARC expression in two groups1-4: experimental group;5-8:control group

圖2 Western blot法測定2組鋅指蛋白41和SPARC含量*P<0.05,與對照組相比Fig.2 Western blot results of zinc finger protein 41 and SPARC content*P<0.05,compared with control group

2.2 ELISA法檢測2組鋅指蛋白41和SPARC濃度 ELISA結果表明，實驗組鋅指蛋白41和SPARC含量均明顯低于對照組(P<0.05)，見表1。

組別 只數鋅指蛋白41SPARC對照組40137.63±55.34197.05±86.49實驗組40101.67±36.11*141.58±78.73*

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

3 討論

室間隔屬于最常見的先天性心臟病，嚴重影響嬰幼兒的生命健康，具有較高的死亡率[7]。研究認為其發病與環境、遺傳因素有關[8]，但具體的發病機制尚不明確。研究認為[9]，先天性心臟病的發生與心臟發育的信號傳導通路有關，在傳導中起重要作用的是各種蛋白質，鋅指蛋白41和SPARC是研究最多的2種[10]。鋅指蛋白41屬于DNA轉錄因子，能夠與DNA結合，調控DNA活性，影響心臟發育所必需蛋白質的產生，參與心肌細胞增殖和心臟形成過程[11]；SPARC亦稱骨連接蛋白，具有影響組織分化、參與胚胎發育、調節細胞的黏附與遷移、抑制內皮DNA合成等作用[12]。很多研究表明，在室間隔缺損患者血清中鋅指蛋白41和SPARC表達水平均有所升高，可以作為評價室間隔缺損的血清標志物[13]。本研究即通過觀察烏頭堿對室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和SPARC的影響，來探索烏頭堿對室間隔缺損的作用。

Western blot法和ELISA法是目前蛋白組學定性定量檢測最常用的辦法，2者在應用上各有側重，本研究聯合應用以提高結果的準確性。Western blot結果表明，實驗組鋅指蛋白41和SPARC相對表達值均明顯低于對照組(P<0.05)；ELISA結果表明，實驗組鋅指蛋白41和SPARC含量均明顯低于對照組(P<0.05)；提示烏頭堿能夠明顯降低室間隔缺損大鼠血清中鋅指蛋白41和SPARC的表達及含量，這可能與烏頭堿能夠影響心肌細胞膜內鈣離子通道的開合，導致鈣超載，鈣信號轉導隨之改變，因而影響鋅指蛋白41和SPARC的表達有關[14]。根據以上研究結果，可以認為烏頭堿對室間隔缺損大鼠有正面作用，但具體的作用機制，還需進一步深入研究。

綜上所述，烏頭堿能夠明顯降低室間隔缺損模型大鼠血清鋅指蛋白41和SPARC的表達水平。

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(編校：吳茜)

Effect of aconitine on serum zinc finger protein 41 and SPARC in ventricular septal defect model rats

YU Cheng

(Department of Heart Surgery, People’s Hospital of Hainan Province, Haikou 57031, China)

ObjectiveTo explore the effect of aconitine on serum zinc finger protein 41 and secreted protein acidic and rich in cysteine in ventricular septal defect model rats.Methods80 ventricular septal defect model rats were randomly divided into two groups, experimental group (n=40) were treated with 0.05 mg/kg aconitine via tail vein injection for 7 consecutive days; control group (n=40) were treated with normal saline via tail vein injection for 7 consecutive days. Then, the abdominal aorta blood of each rat was collected, and the contents of zinc finger protein 41 and SPARC in two groups were detected by Western blot and ELISA method,seperately.ResultsWestern blot results showed that the expression of zinc finger protein 41 and SPARC in serum samples of experimental group were significantly lower than that of control group(P<0.05). ELISA results showed that the contents of zinc finger protein 41 and SPARC of experimental group was significantly lower than that of control group(P<0.05), respectively.ConclusionAconitine can decrease the expression of serum zinc finger protein 41 and SPARC in ventricular septal defect model rat.

aconitine;ventricular septal defect;zinc finger protein 41;secreted protein acidic and rich in cysteine

余成，男，碩士，主治醫師，研究方向：心臟外科，E-mail：yuchen292@163.com。

R541.1

A

1005-1678(2015)03-0042-03