當歸多糖與川芎嗪不同配比對大鼠腦缺血再灌注損傷神經可塑性的影響

劉洛同,明揚,陳禮剛Δ,周杰,彭里磊,孫霞

(1.瀘州醫學院附屬醫院 神經外科，四川 瀘州 646000；2.山東大學 分子藥理學系，山東 濟南 250100)

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當歸多糖與川芎嗪不同配比對大鼠腦缺血再灌注損傷神經可塑性的影響

劉洛同1,明揚1,陳禮剛1Δ,周杰1,彭里磊1,孫霞2

(1.瀘州醫學院附屬醫院 神經外科，四川 瀘州 646000；2.山東大學 分子藥理學系，山東 濟南 250100)

目的 研究低分子量當歸多糖-川芎嗪(LMW-ASP)不同配比對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經可塑性的影響。方法 將42只實驗大鼠隨機分為對照組(N)、假手術組(S)、模型組(M)、50:10組(mg/kg:mg/kg)(E1)、25:10組(E2)、50:20組(E3)、25:20組(E4)。N組不進行任何手術處理，S組除不插線栓外，余同模型組，M、E1、E2、E3、E4組大鼠建立MCAO再灌注模型，其中N、S、M組不給藥治療，腹腔注射相同劑量的生理鹽水，E1-E4分別腹腔注射相應比例的低分子量當歸多糖和川芎嗪，于再灌注即刻開始注藥，1次/日，共7次。分別在再灌注后4 h、24 h、3 d、7 d進行大鼠神經功能缺損評分，并于第7 d多聚甲醛固定后斷頭取腦進行免疫組織化學方法檢測腦梗死周圍皮質MAP-2、SYP的表達。結果 免疫組織化學方法檢測腦梗死灶周圍皮質MAP-2、SYP表達顯示，在第7d，建立腦缺血再灌注損傷模型的各組MAP-2、SYP的免疫活性較N組、S組強，藥物干預組MAP-2、SYP的免疫活性高于M組，且差異均具有統計學意義(P<0.05)；低分子量當歸多糖-川芎嗪不同配比組間MAP-2的免疫活性差異有統計學意義，其活性分別為E3>E1>E4>E2；低分子量當歸多糖-川芎嗪不同配比組間SYP的免疫活性差異均有統計學意義，其活性分別為E3>E1>E4>E2。其比例為50 mg/kg:20 mg/kg時最適宜。結論 大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能部分可自行恢復，低分子量當歸多糖-川芎嗪配伍干預后可促進大鼠腦缺血再灌注損傷腦梗死灶周圍皮質MAP-2、SYP的表達，恢復效果更顯著。

當歸多糖；川芎嗪；大腦缺血再灌注模型

缺血性腦卒中是腦血管疾病發病率最高的一類疾病，其致殘率也居首位[1-3]。本課題以線栓法大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注大鼠為實驗對象，通過觀察MCAO再灌注大鼠腦缺血后神經功能損傷行為學變化、缺血腦組織周圍MAP-2和SYP的表達，探討低分子量當歸多糖與川芎嗪不同配比對腦缺血再灌注損傷的神經可塑性的影響，尋找2者最佳配比。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及術前準備 成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF級，體質量(220 ± 20)g，由上海大學動物實驗中心提供，合格證號4200500164。飼養于上海大學生物安全三級動物實驗室(animalBiosafety Level 3 Laboratory, ABSL-3)，飼養環境保持室溫22 ℃，濕度72%，12 h晝夜交替。術前大鼠環境適應性喂養1周，自由進食、飲水。術前禁食12 h，不禁水。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。線栓總長度40 mm，線頭直徑(0.32±0.02)mm，線身直徑0.24 mm，術前用肝素鈉溶液浸潤備用。

1.2 實驗方法 將42只實驗大鼠隨機分為對照組(N)、假手術組(S)、模型組(M)、50:10組(mg/kg:mg/kg)(E1)、25:10組(E2)、50:20組(E3)、25:20組(E4)。N組不進行任何手術處理，S組除不插線栓外，余同模型組，M、E1、E2、E3、E4組大鼠建立MCAO再灌注模型，其中N、S、M組不給藥治療，腹腔注射相同劑量的生理鹽水，E1-E4分別腹腔注射相應比例的低分子量當歸多糖和川芎嗪，于再灌注即刻開始注藥，1次/天，共7次。分別在再灌注后4 h、24 h、3 d、7 d進行大鼠神經功能缺損評分，并于第7 d多聚甲醛固定后斷頭取腦進行免疫組織化學方法檢測腦梗死周圍皮質MAP-2、SYP的表達。

2 結果

2.1 大腦中動脈缺血再灌注模型的大鼠的基本狀況 納入實驗的SD大鼠共42只，制作MCAO再灌注模型的大鼠30只，整個實驗中制作MCAO再灌注模型實際使用的SD 大鼠42 只，總體造模成功率71.4%，具體情況如下：M：9只，1只在手術后24 h內死亡，1只第2 天死亡，1只在第4 天死亡；E1：8只，1只蘇醒神經功能評分為0 分而剔除實驗，1只在術后24 h內死亡；E2：8只，1只在術中死亡，1只在第2天死亡；E3：9只，1只蘇醒后神經功能評分為4 分剔除實驗，1 只在術后24 h內死亡，1只第7天死亡；E4：8只，1只術后拔線栓時大出血而死亡，1只術后24 h內死亡；對照組，假手術組未出現發生死亡。

2.2 免疫組化測定腦梗死灶周圍皮質MAP-2 表達 采用免疫組化SP 法檢測梗死灶周圍皮質MAP-2表達。在大鼠腦缺血再灌注后第7 d，腦梗死灶周圍皮質MAP-2表達的灰度值明顯低于正常組(N)和假手術組(S)，即MAP-2免疫活性較正常組和假手術組強，差異有統計學意義(P<0.05)；實驗組E1-E4 MAP-2 表達的灰度值低于模型組M(209.54±1.62)，差異具有統計學意義(P<0.05)；低分子量當歸多糖-川芎嗪不同配比干預組中，實驗組E3(200.64 ± 0.95)灰度值最低，MAP-2 的免疫活性最強，實驗組E2(206.49±1.23)灰度值最高，MAP-2免疫活性最弱，MAP-2免疫活性強弱為E3(200.64±0.95)>E1(202.43±1.66)>E4(204.67±1.44)>E2(206.49±1.23)，見圖1。

圖1 各組大鼠在腦缺血再灌注后第7 d腦梗死灶周圍皮質MAP-2的表達(×400)Fig.1 Expression of MAP-2 in cerebral infarction around rats cortex at 7th after cerebral ischemia reperfusion(×400)

2.3 免疫組化測定腦梗死灶周圍皮質SYP 的表達 在大鼠腦缺血再灌注后第7d，建立MCAO 再灌注模型的大鼠腦梗死灶周圍皮質SYP 表達的灰度值明顯低于正常組(N)和假手術組(S)，差異具有統計學意義(P<0.05)；實驗組E1-E4 SYP 表達的灰度值低于模型組M(208.41±1.77)，差異有統計學意義(P<0.05)；低分子量當歸多糖與川芎嗪不同配比干預組中，實驗組E3(197.07±0.63)灰度值最低，SYP 的免疫活性最強，兩者成反比關系，實驗組E2(206.29±0.98)灰度值最高，SYP 免疫活性最弱，在藥物干預組中SYP 免疫活性強弱為E3(197.07±0.63)>E1(199.12±1.31)>E4(203.93±1.74)>E2(206.29±0.98)，見圖2。

圖2 各組大鼠在腦缺血再灌注后第7d 腦梗死灶周圍皮質SYP 的表達(×400)Fig.2 Expression of SYP in cerebral infarction around rats cortex at 7th after cerebral ischemia reperfusion(×400)

3 討論

本實驗通過制備低分子量當歸多糖和研究低分子量當歸多糖-川芎嗪不同配比對大鼠腦缺血再灌注損傷神經功能和腦梗死灶周圍皮質MAP-2、SYP 表達水平的影響，可得到如下結論：

大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能可自行恢復[4-8]，中藥低分子量當歸多糖-川芎嗪配伍干預后恢復效果更顯著。低分子量當歸多糖-川芎嗪不同配比可上調大鼠腦缺血再灌注損傷腦梗死灶周圍皮質MAP-2、SYP 的表達[9]，促進神經的可塑性，比例為50 mg/kg:20 mg/kg 時效果最顯著。

本次研究對于進一步探索低分子量當歸多糖-川芎嗪配伍對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用的最佳比例具有重要意義。

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(編校：譚 玲)

Neuroplasticity effects of compatibility of angelica sinensis polysaccharide and tetramethylpyrazine on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats

LIU Luo-tong1,MING Yang1,CHEN Li-gang1Δ,ZHOU Jie1,PENG Li-lei1,SUN Xia2

(1.Department of Neurosurgery, The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China; 2.Department of Molecular Pharmacology, Shandong University, Ji’nan 250100,China)

ObjectiveTo construct a middle cerebral artery occlusion(MCAO)/reperfusion rat model and study the effect of the different compatibility ratios of LMW-ASP and tetramethylpyrazine on the effects of neuroplasticity, and explore the best compatibility ratio between LMW-ASP and tetramethylpyrazine.MethodsIn the study, 42 experimental rats were divided into seven groups, they were normal group(N), sham operation group(S), model group(M),50:10 group(E1),25:10 group(E2),50:20 group(E3) and 25:20 group(E4).N group would not be carried out any operation, while S group was performed in the same way with M group but without inserting the intraluminal suture.MCAO reperfusion models were established in rats of the M,E1,E2,E3,E4 groups.The corresponding compatibility ratios of LMW-ASP and tetramethylpyrazine were injected to the E1-E4 groups by intraperitoneal injection in reperfusion instantly,once a day,a total of seven times.Neurological severity scores in rats were done in 4 h,24 h,3 d,7 d after reperfusion.In 7 d, The rats brains were removed after fixed using paraformaldehyde and then the immunohistochemistry method was used to detect the expression of MAP-2 and SYP in the cortex around cerebral infarction.ResultsIn 7 d, using the immunohistochemical methods detected the expression of MAP-2 and SYP in the cortex around cerebral infarction.The immune activity of MAP-2 and SYP in groups of cerebral ischemia/reperfusion injury model was stronger than the N group, S group and the difference was significant(P<0.05), and the immune activity of MAP-2 and SYP in the cortex around cerebral infarction in drug intervention groups were stronger than the M group and they had a significant difference(P<0.05); the immune activity of MAP-2 between the different compatibility ratios groups of LMW-ASP and tetramethylpyrazine was statistical difference(P<0.05), and the activity was E3>E1>E4>E2;the immune activity of SYP between the different compatibility ratios groups of LMW-ASP and tetramethylpyrazine was statistical difference(P<0.05), and the activity was E3>E1>E4>E2, and the compatibility ratio of 50 mg/kg:20 mg/kg was best effect. ConclusionsIn this study, we found that neurological function after cerebral ischemia/reperfusion injury can be partially self-recovery and the recovery effect after the drug intervention of the different compatibility ratios between the LMW-ASP and Tetramethylpyrazine is more pronounced.The compatibility of LMW-ASP and tetramethylpyrazine can promote the expression of MAP-2 and SYP in the cortex around cerebral infarction.

angelica sinensis polysaccharide; tetramethylpyrazine; middle cerebral artery occlusion/reperfusion

山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2009QW003)

劉洛同，男，碩士，副主任醫師，研究方向：神經外科，E-mail：qch18214600123@163.com；陳禮剛，通訊作者，男，博士，副主任醫師，研究方向：神經外科，E-mail：qch18214600124@163.com。

R285.5

A

1005-1678(2015)03-0036-03