黃芩苷對牙周炎大鼠牙移動保持階段VEGF、BMP-2及IL-1β表達的影響

李玲

(萊蕪市人民醫院 口腔科，山東 萊蕪 271199)

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黃芩苷對牙周炎大鼠牙移動保持階段VEGF、BMP-2及IL-1β表達的影響

李玲

(萊蕪市人民醫院 口腔科，山東 萊蕪 271199)

目的 觀察黃芩苷對牙周炎大鼠牙移動保持階段血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein，BMP-2)和白介素1β(interleukin，IL-1β)表達的影響，探討黃芩苷對牙周組織改建的作用機制。方法 80只SD大鼠，隨機分為4組，每組20只。空白組不作處理，模型組建立牙周炎模型，對照組與觀察組均建立牙周炎模型，繼而建立牙移動模型，觀察組給予黃芩苷，空白組和對照組給予等量生理鹽水，分別于1、3、6、12、18d時處死大鼠進行免疫組化染色，觀察牙周組織VEGF、BMP-2和IL-1β的表達變化。結果 空白組大鼠BMP-2陽性表達不高，模型組BMP-2表達增強，對照組和觀察組牙周組織BMP-2的表達在加力結束后逐漸降低，但相同時間點比較，觀察組BMP-2表達量低于對照組(P<0.05)。對照組和觀察組牙周組織VEGF表達量在加力結束后均較模型組顯著降低，相同時間點比較，觀察組VEGF表達量均高于對照組(P<0.05)。空白組IL-1β陽性表達不明顯，模型組IL-1β陽性表達明顯增多，對照組和觀察組牙周組織IL-1β表達量在加力結束后逐漸降低，相同時間段組比較，觀察組IL-1β表達量明顯低于對照組(P<0.05)。結論 黃芩苷可顯著減少牙周炎大鼠牙移動后牙周組織中IL-1β表達，降低炎癥反應，抑制骨吸收；增加牙周組織中BMP-2和VEGF表達，促進牙周組織血管形成和成熟，這可能是黃芩苷促進牙周炎大鼠正畸牙移動后保持階段內牙周組織改建的作用機制之一。

牙周炎；黃芩苷；VEGF；BMP-2；IL-1β

隨著社會的不斷發展，人們逐漸意識到錯頜畸形是一種疾病，極大影響顏面美觀和口腔功能，需及時接受正畸治療。但是，成人矯治后出現的牙周炎問題正成為困擾醫生的一大難題。牙周炎發病機制主要是由于菌斑及其毒性產物致使牙周組織炎癥，并且激活宿主細胞，從而釋放多種炎癥介質[1-2]。一旦出現牙周炎，可導致牙槽骨吸收、牙周支持組織破壞，患牙受力失衡，從而影響牙齒咬合功能[3]。如何保持牙周炎患者牙齒穩定而理想的位置是正畸治療后的關注重點，機械保持需長期使用，舒適度差；牙周手術風險性高，患者接受度較低[4]。近年來，藥物治療成為研究熱點，研究報道顯示，黃芩苷可抑制炎癥因子，促進牙周膜細胞增殖，保護牙周膜細胞[5]。本文觀察黃芩苷對牙周炎大鼠牙移動保持階段VEGF、BMP-2和IL-1β表達的影響，旨在探討黃芩苷對牙周組織改建的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物：SD大鼠80只，雌雄各半，4周齡，體質量(100±10)g，由北京市實驗動物研究中心提供(合格證號：Scxk(京)-2002-0003)，嚴格遵循《實驗動物保護條例》，適應性飼養7 d后開始實驗。

1.1.2 藥品：黃芩苷購自北京生物制品檢驗所(純度>99%)，取黃芩苷10 g，加注射用水適量懸浮浸潤，滴加2 mol/L氫氧化鈉溶液使黃芩苷溶解，配制成10 g/L的黃芩苷貯存液備用。

1.1.3 試劑與儀器：牙釉質粘結劑(杭州西湖生物材料有限公司)；速眠新(吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司)；多聚甲醛(上海撫生實業有限公司)；VEGF抗體、BMP-2抗體和IL-1β抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；VEGF、BMP-2和IL-1β ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

正畸用測力計(杭州奧索醫療器械有限公司)，YJZ-100型高速渦輪牙鉆機(上海泰益醫療儀器設備有限公司)，高速渦輪牙鉆手機(日本NSK公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 按照隨機數字表法將80只SD大鼠分為空白組(A組)、牙周炎模型組(B組)、對照組(C組)和觀察組(D組)4組，每組20只。A組不作任何處理，后采用心臟灌注法處死，制作組織學標本，進行免疫組化染色。B組大鼠建立牙周炎模型后采用心臟灌注法處死，制作組織學標本，進行免疫組化染色。C組大鼠建立牙周炎模型，繼而建立牙移動模型，于加力裝置去除前一天開始腹腔注射生理鹽水，1次/天，分別于1、3、6、12、18d時心臟灌注處死，制作組織學標本，進行免疫組化染色。D組大鼠建立牙周炎模型，繼而建立牙移動模型，于加力裝置去除前1天開始腹腔注射黃芩苷溶液40mg/kg，1次/天，分別于1、3、6、12、18d時心臟灌注處死，制作組織學標本，進行免疫組化染色。

1.2.2 大鼠牙周炎模型建立：大鼠肌內注射0.25 mL/kg速眠新麻醉，動物麻醉后仰臥固定于手術臺，采用高速渦輪牙鉆機

在大鼠上頜雙側第一磨牙近中頰側牙頸部磨一淺的固位溝，用口腔正畸結扎鋼絲結扎雙側上頜第二磨牙牙頸部1圈。術后給予高糖飲食，喂養軟食，30 d后形成大鼠牙周炎模型[6]。

1.2.3 大鼠牙移動模型建立：牙周炎模型大鼠麻醉后仰臥固定于手術臺，用高速渦輪牙鉆機在大鼠上頜2顆切牙遠中磨一淺的固位溝，用結扎絲將螺旋彈簧的一端結扎于上頜第一磨牙牙頸部固位溝，另一端結扎在上頜切牙固位溝內牽引上頜雙側第一磨牙近中移動，清潔后酸蝕2顆切牙結扎絲周圍牙面，干燥后用釉質粘結劑固定，共持續18d[7]。

1.2.4 牙移動后保持階段動物模型建立：牙移動結束后去除大鼠口內加力裝置，以左側上頜牙弓作為實驗的保持側，以結扎絲連扎于左側上頜第一磨牙和切牙之間，切牙結扎處涂布粘結劑固定，分別保持1、3、6、12、18d[8]。

1.2.5 免疫組化染色：各組大鼠灌注結束后解剖取出上頜骨，浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h。之后浸泡于10% EDTA液中于4 ℃脫鈣約30 d。PBS沖洗干凈組織塊后石蠟包埋，從腭側向頰側的方向進行切片，選擇斷面為完整牙周韌帶的切片進行觀察，進行免疫組化染色。觀察各組大鼠牙周組織IL-1β、BMP-2和VEGF的水平變化。

2 結果

2.1 各組大鼠牙周組織中BMP-2免疫組化染色結果分析 胞質內BMP-2陽性細胞以淡黃色和棕褐色顆粒為主，胞核和胞膜上少見。見圖1。空白組大鼠BMP-2陽性表達不高，模型組BMP-2表達增強，牙槽骨表面可見新骨形成。對照組和觀察組牙周組織BMP-2的表達在加力結束后逐漸降低，但相同時間點比較，觀察組BMP-2表達量高于對照組(P<0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠牙周組織BMP-2免疫組化染色結果(×200)Fig.1 BMP-2 immunohistochemical staining results in periodontal tissues of rats(×200)

組別 只數BMP-2表達1d3d6d12d18d空白組460.33±2.14 64.92±2.89 68.31±3.02 90.04±2.78 93.21±2.51 模型組4265.31±3.57269.41±3.01274.98±2.35277.36±3.49284.56±2.69對照組4133.06±0.97126.94±1.56118.90±1.47111.91±2.25108.89±1.38觀察組4139.18±1.01*130.85±1.21*125.01±3.24*116.76±1.90*112.89±1.51*

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group

2.2 牙周組織中VEGF免疫組化染色結果分析 光學顯微鏡下觀察可見，胞質內VEGF陽性細胞以淡黃色和棕褐色顆粒為主，胞核和胞膜上未見明顯染色，主要分布于牙周膜、血管內壁和牙髓腔中，見圖2。對照組和觀察組牙周組織VEGF表達量在加力結束后均較模型組顯著降低，相同時間點比較，觀察組VEGF表達量均高于對照組(P<0.05)，見表2。

圖2 各組大鼠牙周組織VEGF免疫組化染色結果(×200)Fig.2 VEGF immunohistochemical staining resultsin periodontal tissues of rats(×200)

組別 只數VEGF表達1d3d6d12d18d空白組476.35±4.0280.21±3.9883.51±2.9686.73±3.1187.21±2.65模型組4205.76±3.11211.84±2.81218.29±1.87226.33±2.65231.57±3.07對照組4121.93±1.51116.85±1.26112.80±1.50107.79±1.29104.79±1.27觀察組4127.95±1.53*122.03±1.49*118.81±1.24*109.97±1.72*109.97±1.72*

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group

2.3 牙周組織中IL-1β免疫組化染色結果分析 光學顯微鏡下觀察，胞質內IL-1β陽性細胞以淡黃色和棕褐色顆粒為主，胞核和胞膜上未見。IL-1β表達陽性的細胞有成纖維細胞、單核-巨噬細胞、破骨細胞及中性粒細胞。由圖3可見，空白組未見明顯陽性染色，模型組IL-1β陽性表達明顯增多。對照組和觀察組牙周組織IL-1β表達量在加力結束后逐漸降低，相同時間段組比較，觀察組IL-1β表達量明顯低于對照組(P<0.05)，見表3。

圖3 各組大鼠牙周組織IL-1β免疫組化染色結果(×200)Fig.3 IL-1β immunohistochemical staining resultsin periodontal tissues of rats(×200)

組別 只數IL-1β表達1d3d6d12d18d空白組487.32±2.0990.21±1.8783.57±1.6792.14±2.3596.31±1.93模型組4245.91±3.08263.84±2.68258.27±2.31273.41±1.95283.15±3.22對照組4116.97±1.10121.18±1.19125.10±1.54127.82±1.27132.01±1.16觀察組4112.21±1.34*117.78±1.30*121.00±1.28*123.93±1.56*127.13±1.33*

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group

3 討論

近年來，成人正畸患者數急劇增加，大部分具有不同程度的牙周病損。牙周病已成為影響人類口腔健康的主要疾病，在全球范圍內具有極高的患病率，而我國患病率更是高達95%。牙周炎的主要特征是牙周袋形成和袋壁的炎癥、牙槽骨吸收，可導致患者牙齒松動和移位，繼發畸形和殆創傷，是成人牙齒喪失的主要原因，嚴重危害人類健康[9]。目前，正畸治療是牙周病治療的重要手段。眾多研究顯示，藥物治療可達到控制牙齒移動，增加支持的目的。

黃芩苷是從唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根中提取而來，屬于黃酮類化合物。現代藥理學研究顯示，黃芩苷生物活性顯著，具有解熱、降壓、利尿、抗菌、抗炎、抗變態反應等多種作用[10-11]。近年來，通過不斷探索黃芩苷對牙周炎的作用發現，黃芩苷可保護牙周膜成纖維細胞，促進牙周膜細胞增殖，抑制TNF-α，降低IL-6含量[12]。此外，黃芩苷對LPS介導的IL-1β也有抑制作用，顯著促進成纖維細胞增殖及其膠原蛋白合成。

VEGF可促進血管內皮細胞分泌骨生長因子，刺激成骨細胞生長[13]。此外，VEGF還可能與成骨細胞遷移和分化相關，參與骨改建。BMP-2屬于TGF-β超家族成員，決定骨祖細胞分化，是一種高效的骨誘導物質，可誘導間充質細胞向骨細胞系分化，加速礦化結節形成，參與牙齒移動過程中的骨改建[14]。因此，BMP-2可用來衡量骨形成是否活躍。IL-1是炎性因子級聯反應的始動因子，其中IL-1β對維持機體穩態和心血管疾病具有重要調節作用。IL-1β是牙周炎的破壞因子，具有催化牙槽骨吸收的作用。眾多研究顯示，IL-1β可刺激骨吸收，抑制骨形成，抑制金屬蛋白酶組織抑制因子，從而導致結締組織降解[15]。因此，本文以VEGF、BMP-2和IL-1β作為檢測指標評價黃芩苷對牙周炎大鼠牙移動保持階段牙周組織抗炎方面的骨改建作用。

本研究結果顯示，對照組和觀察組牙周組織BMP-2和VEGF表達量在加力結束后呈逐漸減少的趨勢，相同時間點比較，實驗組BMP-2和VEGF表達量均高于對照組(P<0.05)。而對照組和觀察組牙周組織IL-1β表達量在加力結束后逐漸增加，相同時間點比較，實驗組IL-1β表達量明顯低于對照組(P<0.05)。綜上所述，黃芩苷可顯著減少牙周炎大鼠牙移動后牙周組織中IL-1β表達，降低炎癥反應，抑制骨吸收；增加牙周組織中BMP-2和VEGF表達，促進牙周組織血管形成和成熟，這可能是黃芩苷促進牙周炎大鼠正畸牙移動后保持階段內牙周組織改建的作用機制之一。

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(編校：王儼儼)

Effect of baicalin on expression of VEGF, BMP-2 and IL-1β in rat mobile dental periodontitis maintained phase

LI Ling

(Department of Stomatology, People’s Hospital of Laiwu City, Laiwu 271199, China)

ObjectiveTo observe effect of baicalin on VEGF, BMP-2 and IL-1β expression in rat mobile dental periodontitis maintained phase, and explore the mechanism of baicalin on periodontal tissue remodeling.Methods80 SD rats were randomly divided into four groups,20 rats in each group. The blank group weren’t giren any treatment, model group were built with periodontitis, control group and observation group were built with periodontitis and then tooth movement model. The observation group were given baicalin, blank group and control group were given the same volume of saline. The rats were killed at 1d, 3d, 6d, 12d, 18d, then samples of the maxilla were taken to make tissue sections and immunohistochemical staining. VEGF, BMP-2 and IL-1β expression were observed in periodontal tissue.ResultsThe BMP-2 expression isn’t obvious in blank group, but was obvious in model group, and gradually reduced at the end of the afterburner; BMP-2 expression in experimental group were higher than that in control group at the same point (P<0.05). The VEGF expression in control group and experimental group gradually reduced at the end of the afterburner; VEGF expression in experimental group were lower than that in control group at the same point (P<0.05). The IL-1β expression wasn’t obvious in blank group, but was obvious in model group. The IL-1β expression in control group and experimental group gradually reduced at the end of the afterburner; IL-1β expression in experimental group were lower than that in control group at the same point (P<0.05).ConclusionBaicalin can significantly increase the expression of IL-1β in periodontal tissues of periodontitis rats after moving teeth, reduce inflammation, inhibit bone resorption, and also increase BMP-2 and VEGF expression, promote periodontal vessel formation and maturation, which may be one of the mechanisms of baicalin to promote periodontal tissue remodeling in periodontitis rats at holding phase after orthodontic tooth movement.

periodontitis; baicalin; VEGF; BMP-2; IL-1β

李玲，女，主治醫師，學士，研究方向：口腔，E-mail：liling15763499755@163.com。

R781.42

A

1005-1678(2015)03-0032-04