冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后的保護作用

劉麗娟,范蕾,常福厚,白圖雅,呂小麗,李凌

(內蒙古醫科大學 藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110)

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冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后的保護作用

劉麗娟,范蕾Δ,常福厚,白圖雅,呂小麗,李凌

(內蒙古醫科大學 藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110)

目的 研究冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的保護作用。方法 50只Wistar大鼠隨機分成正常組、模型組、冠心十味丸低、高劑量組(0.3、0.9 mg/kg)、陽性對照組(復方丹參滴丸處理液)，每組各10只。構建離體大鼠心臟再灌注實驗模型，測定給藥后70 min各組大鼠心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶的含量。結果 與模型組相比，冠心十味丸可明顯升高心肌缺血再灌注損傷時SOD、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶活性(P<0.05或P<0.01)，降低缺血再灌注損傷時LDH、CK活性,減少MDA含量(P<0.05 或P<0.01)。結論 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血；再灌注損傷具有保護作用。

冠心十味丸；心肌缺血再灌注損傷；心肌酶

冠心十味丸是由內蒙古醫科大學自主開發的新藥，該藥由蒙醫古方而來，由十味中蒙藥材組成，按照君、臣、佐、使，科學組方設計而成，主要具有調心“赫依”、血相搏、活血、安心、化脂等功效，用于心煩、心區刺痛，心供血不足等。對于現代醫學可用來治療冠心病、高血脂、高血壓等疾病。本研究根據其功能主治，研究冠心十味丸對心肌缺血和心肌梗塞的保護作用，為其臨床應用提供藥效學依據。本實驗擬采用離體大鼠心臟全心缺血再灌流法[1-2]，研究冠心十味丸對離體心臟全心缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雄性Wistar大鼠，180～220 g， 共50只。 清潔二級，來自內蒙古大學動物室，合格證號 (京動字) 第 8806R011 號。

1.1.2 藥品與試劑：冠心十味丸(內蒙古醫科大學藥學院自制，批號：130207048)，氯化鈉注射液(河北天成藥業股份有限公司，批號：12122510)，25%烏拉坦(北京化工廠，批號：120125)，SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產批號：20130218)，LDH(南京建成生物工程研究所，生產批號：20130420)，CK(南京建成生物工程研究所，生產批號：20130211)，MDA(南京建成生物工程研究所，生產批號：20130303)，Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，生產批號：20130328，規格：100 T/96樣)，復方丹參滴丸(天津天士力制藥股份有限公司，生產批號：120710)。

1.1.3 儀器：GL-2離體心臟灌流系統、YY-2藥液泵、HW-1000超級恒溫水浴(成都泰盟科技有限公司)，TG-16微量高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，旋片式真空泵(浙江飛躍機電有限公司)，TUBE MIXER TRIO數顯恒溫三用水箱(上海梅香儀器有限公司)，TG16-微量高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，YU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組和給藥：50只大鼠隨機分成正常組、模型組、低劑量組、高劑量組、陽性對照組，各10只。正常組：平衡灌流70 min；模型組：平衡20 min，灌流10 min，停灌20 min，再灌20 min；冠心十味丸低劑量組和高劑量組：平衡20 min，含藥灌10 min，停灌20 min，再含藥灌20 min(低劑量給藥量：0.3 mg/kg，高劑量給藥量：0.9 mg/kg)；陽性對照組：平衡20 min，含復方丹參滴丸處理液灌流10 min，停灌20 min，再含藥灌20 min(給藥量：0.05 mg/kg)。

1.2.2 大鼠離體心臟全心缺血—再灌注(I/R)模型制備：術前皮下注射25%的烏拉坦0.4～0.6 mL/100g,麻醉后快速開胸，剪破心包膜，剪斷上下腔靜脈、肺動脈、主動脈(保留1 cm左右)及心臟周圍組織，取心臟置于冰的Kreb’s-Henseleit溶液中清洗除去污血，剔除血管、脂肪等非心肌組織，掛于GL-2離體心臟系統上進行灌流，灌流液采用氧飽和的37 ℃ K-H溶液。灌流結束后，用吸水紙吸取心臟水分，取左心室稱重，凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 組織勻漿制備與測定：從-80 ℃冰箱中取出左心室，解凍，用十字勻漿器冰水浴研磨，按心臟組織g重/生理鹽水mL數1:9將組織液制備成10%勻漿，然后低溫超速離心3500 r/min 離心10 min,取上清液，再用生理鹽水稀釋成1%的勻漿，嚴格按試劑盒說明書操作，考馬斯亮藍法測定心肌組織蛋白含量，測定心肌勻漿SOD、CK、LDH、MDA、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶；1%心肌組織勻漿的蛋白濃度為0.525 mg·prot/mL。

2 結果

2.1 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后SOD的影響 與正常組相比，模型組SOD酶活性顯著降低(P<0.05)；與模型組相比,冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后SOD值明顯升高(P<0.01)，即冠心十味丸可以升高心肌缺血再灌注損傷時SOD酶活性。見表1。

表1 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后SOD的影響±s)Fig.1 Effect of GuanXinShiWeiWan on SOD activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.2 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后LDH的影響 與正常組相比，模型組LDH含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比, 冠心十味丸組(0.9 mg/kg,0.3 mg/kg)再灌注損傷后LDH值明顯降低(P<0.05)，即冠心十味丸可以降低心肌缺血再灌注損傷后LDH活性。見表2。

表2 冠心十味丸對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后LDH的影響±s)Fig.2 Effect of GuanXinShiWeiWan on LDH activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組對比較，compared with model group

2.3 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后MDA的影響 與正常組相比，模型組MDA含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比, 冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后MDA值明顯降低(P<0.01), 即冠心十味丸膠囊可以減少心肌缺血再灌注損傷后MDA含量。見表3。

表3 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后MDA的影響±s)Fig.3 Effect of GuanXinShiWeiWan on MDA content of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.4 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后CK的影響 與正常組相比，模型組CK活性顯著升高(P<0.01)；與模型組相比, 冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后CK值明顯降低(P<0.01)，即冠心十味丸膠囊可以降低心肌缺血再灌注損傷后CK活性。見表4。

表4 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后CK的影響±s)Fig.4 Effect of GuanXinShiWeiWan on CK activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△△P<0.01，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.5 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Ca2+-ATP酶活力的影響 與正常組相比，模型組Ca2+-ATP酶活性顯著升高(P<0.05)；與模型組相比, 冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后Ca2+-ATP酶值明顯升高(P<0.01)，即冠心十味丸膠囊可以升高心肌缺血再灌注損傷后Ca2+-ATP酶活性。見表5。

表5 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Ca2+-ATP酶 活力的影響±s)Fig.5 Effect of GuanXinShiWeiWan on Ca2+-ATP activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.6 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Ca2+- Mg2+-ATP酶活力的影響 與正常組相比，模型組Ca2+- Mg2+-ATP酶活性顯著升高(P<0.01)；與模型組相比,冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后Ca2+-Mg2+-ATP酶值明顯升高(P<0.01)，即冠心十味丸膠囊可以升高心肌缺血再灌注損傷后Ca2+- Mg2+-ATP酶活性。見表6。

表6 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Ca2+- Mg2+-ATP酶 活力的影響±s)Fig.6 Effect of GuanXinShiWeiWan on Ca2+-Mg2+-ATP activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△△P<0.01，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

2.7 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Na+- K+-ATP酶活力的影響 與正常組相比，模型組Na+- K+-ATP酶活力顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，冠心十味丸組(0.9 mg/kg，0.3 mg/kg)再灌注損傷后Na+- K+-ATP酶值明顯升高(P<0.01)，即冠心十味丸可以升高心肌缺血再灌注損傷后Na+-K+-ATP酶活性。見表7。

表7 冠心十味丸對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后Na+- K+-ATP酶 活力的影響±s)Fig.7 Effect of GuanXinShiWeiWan on Na+- K+-ATP activity of ischemia reperfusion(I-R) injury ±s)

△P<0.05，與正常組比較，compared with normal group；**P<0.01，與模型組比較，compared with model group

3 討論

目前認為,心肌缺血再灌注損傷的機制與心肌能量代謝障礙、氧自由基大量產生、細胞內鈣離子超載、血管內皮細胞分泌一系列內皮因子等因素有關[3-5]。實驗中，模型組離體大鼠心肌缺血再灌注損傷后，心肌組織SOD、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶活性下降，CK、LDH活性升高，MDA含量升高。當組織細胞缺血、缺氧時，氧自由基清除系統功能降低或喪失，而生成系統卻活性增強，一旦恢復組織血液供應和氧供，氧自由基便大量產生與急劇堆積，以不同方式造成細胞急性或慢性損傷, SOD可清除氧自由基，使細胞免受氧自由基的毒性損傷[6]；丙二醛(MDA)是過氧化脂質的一種重要分解產物，常被用作為脂質過氧化程度的檢測指標，它可間接反映體內的氧化應激水平。而SOD作為內源性的自由基清除劑，對過氧化脂質的形成有阻止作用。缺血再灌注后產生的大量氧自由基及通過與不飽和脂肪酸作用引發脂質過氧化反應生成的MDA，可通過多種途徑造成細胞膜及亞細胞器膜結構破壞，導致再灌注損傷[7-9]。SOD是內源性氧自由基清除劑，而MDA是脂質過氧化反應的終產物，2者是能反映氧自由基的產生及引發脂質過氧化反應程度的指標[10]。細胞內鈣離子(Ca2+)濃度的改變是造成MIRI的重要原因之一。當心肌細胞缺血缺氧時，線粒體功能障礙導致ATP生成減少，再灌注后，細胞內Ca2+增加，刺激線粒體鈣泵攝Ca2+，Ca2+與線粒體內含磷酸根的化合物結合，形成沉淀，干擾線粒體的氧化磷酸化：Ca2+濃度升高可激活多種磷脂酶，促進膜磷脂分解，造成生物膜的損傷：由于Na+/Ca2+交換增加，形成一過性內向性離子流，在心肌動作電位后形成遲后除極而引起心律失常；缺血再灌注后，細胞重新獲得能量，在胞漿中高濃度Ca2+的條件下，肌原纖維過度收縮，導致細胞凋亡 。由此可見，降低細胞內Ca2+超載是再灌注損傷時心肌保護的關鍵環節[11]。

本實驗表明，冠心十味丸使SOD、Ca2+-ATP酶、Ca2+- Mg2+-ATP酶、Na+- K+-ATP酶的含量不同程度升高，可抑制乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的活性，并一定程度上減少了丙二醛(MDA)的生成，提示冠心十味丸可通過提高氧自由基清除劑的活力、增強心肌抗氧化能力、抑制心肌脂質過氧化、減輕心肌缺血再灌注損傷時鈣超載而保護心肌達到預防MIRI的目的，并改善心肌缺血再灌注損傷后心臟功能。

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(編校：吳茜)

Protective effect of GuanXinShiWeiWan on isolated rat hearts with ischemia reperfusion injury

LIU Li-juan,FAN LeiΔ,CHANG Fu-hou,BAI Tu-ya,LV Xiao-li,LI Lin

(College of Phamacy, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of GuanXinShiWeiWan on ischemia reperfusion(I-R) injury rat.Methods50 Wistar rats were randomly divided into normal group, model group, GuanXinShiWeiWan low (0.3 mg/kg)and high(0.9 mg/kg) dose group and positive group, each had 10 rats.Adopting the model of ischemia reperfusion injury of isolated rat hearts, the contents of SOD，MDA，LDH，CK and Ca2+-ATP，Ca2+- Mg2+-ATP，Na+- K+-ATP in cardiac muscle tissue were tested and compared.ResultsCompared with model group, GuanXinShiWeiWan significantly improved the activities of SOD、Ca2+-ATP，Ca2+- Mg2+-ATP and Na+- K+-ATP (P<0.05 orP<0.01) in cardiac muscle tissue which injured by ischemia reperfusion, while reducing markedly the contents of MDA，LDH，CK(P<0.05 orP<0.01).ConclusionGuanXinShiWeiWan can profect the cardiac muscle of ischemia reperfusion.

GuanXinShiWeiWan;myocardial ischemia reperfusion injury;cardiac enzyme

劉麗娟，女，碩士在讀，研究方向：微生物與生化藥學，E-mail：994097848@qq.com；范蕾，通訊作者，女，副教授，碩士，研究方向：中蒙藥藥理學研究，E-mail：826368267@qq.com。

R961.1

A

1005-1678(2015)03-0021-04