HPGFC法檢測(cè)抗乙肝胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子高分子量物質(zhì)的研究

張浩軍，馮玉康，張怡，王文鵬，修亞麗，姜國(guó)志，張明正，王正品

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥開(kāi)發(fā)技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430；3.辛集市第一醫(yī)院 病理科，河北 辛集 052360；4.希百壽藥業(yè)有限公司，河南 開(kāi)封 475003)

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HPGFC法檢測(cè)抗乙肝胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子高分子量物質(zhì)的研究

張浩軍1Δ，馮玉康1，張怡3，王文鵬1，修亞麗1，姜國(guó)志2，張明正4，王正品2

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥開(kāi)發(fā)技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430；3.辛集市第一醫(yī)院 病理科，河北 辛集 052360；4.希百壽藥業(yè)有限公司，河南 開(kāi)封 475003)

目的 測(cè)定抗乙型肝炎胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子(anti-HBV placenta transfer factor，PSTF)的高分子物質(zhì)組成和分子量。方法 利用柱色譜法將PSTF中高分子量的組份分離，再采用高效凝膠過(guò)濾色譜法(high performance gel filtration chromatography，HPGFC)測(cè)定PSTF組份中高分子量物質(zhì)的分子量。結(jié)果 通過(guò)對(duì)分離到的PSTF中高分子量成份的檢測(cè)，其分子量為9485.9Da。結(jié)論 PSTF應(yīng)是多肽和核苷酸的復(fù)合物。

抗乙型肝炎胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子；高效凝膠過(guò)濾色譜；高分子量物質(zhì)

抗乙肝胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子采用健康產(chǎn)婦分娩的HBsAg陽(yáng)性胎盤(pán)，經(jīng)提取超濾精制而成，用于慢性乙肝的治療。自20世紀(jì)80年代在我國(guó)試制成功，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察均證明具有免疫活性，臨床使用獲得較好的效果，尤其對(duì)病毒性肝炎療效較顯著[1-5]。抗乙型肝炎胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子(anti-HBV placenta transfer factor,PSTF)屬免疫調(diào)節(jié)劑，是低分子量制劑(規(guī)定分子量小于1萬(wàn))。為確保臨床用藥的安全和有效，需對(duì)樣品做分子量限度檢查。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laster desorption ionization-time of flight mass spectrometer,MALDI-TOF-MS)檢測(cè)其主成份分子量為2942 Da，高分子量物質(zhì)為8197 Da[6]。質(zhì)譜法檢測(cè)雖精確，但操作難度大且檢測(cè)費(fèi)用昂貴。HPGFC法在檢測(cè)精度和便捷性之間取得較好的平衡。

本文采用高效凝膠過(guò)濾色譜(HPGFC)對(duì)3批抗乙型肝炎胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子注射液(以下簡(jiǎn)稱：樣品)進(jìn)行分子量測(cè)定實(shí)驗(yàn)。取核糖核酸酶A、人胰島素和生長(zhǎng)抑素的保留時(shí)間(Rt)和分子量的對(duì)數(shù)值(lg Mr)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程lg Mr=a+b×Rt。在回歸方程中b為負(fù)值，分子量越大則保留時(shí)間小，將樣品色譜圖中各峰的保留時(shí)間代入回歸方程，計(jì)算得到該保留時(shí)間下的分子量。根據(jù)最早峰的保留時(shí)間即可判定樣品中的高分子物質(zhì)的分子量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器： Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 1100高效液相色譜儀(Agilent科技(中國(guó))有限公司)；756PC紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑 ： 供試品：抗乙型肝炎胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子注射液(希百壽藥業(yè)，批號(hào)：20121101，20121102，20121103)。

對(duì)照品：核糖核酸酶A(分子量：13700 Da，批號(hào)：140653-201203)、人胰島素(分子量：5808 Da，批號(hào)：140654-201203)和生長(zhǎng)抑素(分子量：1638 Da，批號(hào)：140656-201203)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件[7]：色譜柱： YMC Pack Diol-200 (300 mm×8.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0(內(nèi)含0.05% NaN3，0.1 mol/L Na2SO4)；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.6 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm。

1.2.2 對(duì)照溶液的制備：將核糖核酸酶A、人胰島素和生長(zhǎng)抑素分別用流動(dòng)相溶解，配制成濃度為2 mg/mL。進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 樣品處理：精密量取本供試品0.5 mL置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

1.2.4 檢測(cè)方法：取稀釋20倍的樣品20 μL 注入色譜儀，記錄譜圖。

1.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：將等體積的核糖核酸酶A、人胰島素和生長(zhǎng)抑素溶液分別與樣品混合，分次注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。計(jì)算連續(xù)進(jìn)樣6次保留時(shí)間的RSD 。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)：取對(duì)照品適量依1.2.2項(xiàng)下處理，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算RSD。

1.2.7 中間精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品適量按1.2.2項(xiàng)處理，在同一實(shí)驗(yàn)室，采用不同實(shí)驗(yàn)人、不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間和不同儀器操作，按上述方法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣3次；2臺(tái)色譜儀同法進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算RSD。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取對(duì)照品適量依1.2.2處理，在0、4、8、12、18、24 h，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算RSD。

1.2.9 樣品各組份的分離、純化：分離用SephadexG 75凝膠柱，柱規(guī)格為100 cm×1.5 cm，洗脫液為0.2 mol/L NaCl，流速為40 mL/h，上柱樣品經(jīng)減壓濃縮至50 mg/mL，上樣量為4 mL，用自動(dòng)記錄儀檢測(cè)，收集液在200～400 nm進(jìn)行掃描。各組份保存待驗(yàn)。對(duì)最早出峰組份進(jìn)行純度鑒定。

1.3 樣品組份的測(cè)定：分別將核糖核酸酶A、人胰島素和生長(zhǎng)抑素及樣品第一組份注入色譜，記錄色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 樣品和對(duì)照品色譜圖 樣品出現(xiàn)4個(gè)主要峰，與對(duì)照品色譜峰無(wú)重疊，用分子篩柱能夠較好的分離。見(jiàn)圖1。

圖1 樣品和對(duì)照品的HPLC色譜圖

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 連續(xù)進(jìn)樣6次保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2%，見(jiàn)表1。表明核糖核酸酶A、人胰島素、生長(zhǎng)抑素與樣品在色譜系統(tǒng)的系統(tǒng)適用性良好。色譜圖結(jié)果表明對(duì)照品與樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

表1 核糖核酸酶A、人胰島素和生長(zhǎng)抑素分別在樣品中的保留時(shí)間

圖2 各對(duì)照品與樣品的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC Chromatography of each reference substance and sample with PSTF

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 該方法下RSD小于2.0%，表明對(duì)照品重復(fù)性良好。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照品的保留時(shí)間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 中間精密度試驗(yàn) 該方法下RSD小于2.0%，表明對(duì)照品中間精密度良好。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照品各成分保留時(shí)間的中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 該方法下RSD小于2.0%，表明對(duì)照品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表4。

表4 對(duì)照品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品各組份分離、純化 峰1是高分子量物質(zhì)，對(duì)其按1.2.1法進(jìn)行純度鑒定為92%以上。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 SephadexG-75的色譜圖Fig.3 Chromatography of SephadexG-75

圖4 峰1的色譜圖Fig.4 Chromatography of peak 1

2.7 樣品的紫外吸收光譜 在 254nm處有最大紫外吸收。見(jiàn)圖5。

圖5 峰1的紫外吸收光譜Fig.5 UV absorption chromatography of peak 1

2.8 分子量計(jì)算[8]對(duì)照品的回歸方程lg Mr=5.2881-0.0635×Rt，R=0.999。樣品中分離純化后峰1中多肽的保留時(shí)間見(jiàn)表5。表5結(jié)果表明該方法下RSD小于2.0%，表明樣品重復(fù)性良好。分子量9485.9 Da。用標(biāo)準(zhǔn)曲線求得，未分離純化的樣品峰1中多肽的分子量為9440.5 Da。

表5 樣品中峰1的保留時(shí)間

3 討論

抗乙肝胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子經(jīng)HPGFC分析，有4個(gè)組份，以峰2和峰3含量最高，占峰面積的91.5%；峰1占峰面積的5.3% 。經(jīng)分離純化后峰1為樣品中分子量最大的組份，多肽分子量為9485.9 Da；且與樣品色譜圖中峰1保留時(shí)間計(jì)算得的多肽分子量變化不大。檢測(cè)樣品峰1組份分子量時(shí)可不必分離后再檢測(cè)。

經(jīng)檢測(cè)峰1純品水溶液在254 nm處有最大吸收，254 nm為核苷酸堿基的吸收。推測(cè)峰1是多肽和核苷酸的復(fù)合物。化學(xué)法測(cè)定樣品中核苷酸的含量為80 μg/mL，多肽含量為0.6 mg/mL，多肽:核酸=7.5:1。曾有文獻(xiàn)報(bào)道，抗乙型肝炎胎盤(pán)轉(zhuǎn)移因子確為多肽和核酸的混合物，水解后測(cè)得17種氨基酸[9]，與之相符。

MALDI-TOF-MS已廣泛用于多肽、糖、核酸等生物大分子的分子量測(cè)定[10-12]。不同的待測(cè)材料所選用的基質(zhì)也不相同[13]，經(jīng)此法檢測(cè)樣品中高分子量多肽的分子量為8197 Da；較本文測(cè)得峰1的分子量9485.9 Da偏小，通過(guò)對(duì)3批樣品的檢測(cè)，結(jié)果一致。 這很可能與多肽結(jié)合低分子量核苷酸有關(guān)。將來(lái)在質(zhì)量控制時(shí)應(yīng)對(duì)多肽和核酸的分子量分別予以關(guān)注。

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(編校：王冬梅)

Study on high molecular component of anti-HBV placenta transfer factor by HPGFC

ZHANG Hao-jun1Δ, FENG Yu-kang1, ZHANG Yi3, WANG Wen-peng1, XIU Ya-li1, JIANG Guo-zhi2, ZHANG Ming-zheng4, WANG Zheng-pin2

(1.Shineway Pharmaceutical Group Co., Ltd.，Shijiazhuang 051430, China; 2.State-Local Joint Engineering Lab.of New Drugs Development Technology for TCM Injection, Shijiazhuang 051430, China; 3.Department of Pathology, The First Hospital of Xinji, Xinji 052360, China; 4.Sepaso Pharmaceutical Co., Ltd., Kaifeng 475003, China)

ObjectiveTo determine high molecular component and high molecular weight of anti-HBV placenta transfer factor(PSTF).MethodsUsed the gel column chromatography to separate component of PSTF.Detected molecule weight of the high molecule component of PSTF by HPGFC.ResultsThe molecular weight of the separated high molecular weight component of PSTF is 9485.9Da.ConclusionPSTF is a complex of peptides and nucleotides.

PSTF; HPGFC; high molecular compoent

國(guó)家重大專項(xiàng)(2011ZX09401-306-004)

張浩軍，通信作者，男，碩士，工程師，研究方向：藥品工藝技術(shù)、質(zhì)量研究及產(chǎn)業(yè)化研究，E-mail：13931197421@139.com。

R979.5

A

1005-1678(2015)10-0134-04