麻黃內生真菌產麻黃類生物堿情況研究

蔡盡忠，何少貴，胡佳

(廈門華廈學院 檢驗科學與技術系，福建 廈門 361024)

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麻黃內生真菌產麻黃類生物堿情況研究

蔡盡忠Δ，何少貴，胡佳

(廈門華廈學院 檢驗科學與技術系，福建 廈門 361024)

目的 從珍稀藥用植物麻黃中分離內生真菌，檢測其麻黃類生物堿產生情況，并探索最優發酵條件。方法 處理麻黃草質莖并分離內生真菌，碘化鉍鉀試劑初檢生物堿，以麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿為對照采用HPLC法篩選產生麻黃類生物堿的菌株，以HPLC法檢測總麻黃類生物堿含量并以其為評價指標篩選出碳源及氮源種類后，以碳源量、氮源量、pH值、溫度、發酵時間5個考察因素設計L16(45)進行正交試驗，從而確定最佳發酵培養基和發酵條件。結果 麻黃草質莖中的內生真菌Es2發酵后菌絲體提取物含有麻黃堿、偽麻黃堿及甲基麻黃堿；Es3發酵后菌絲體提取物含有偽麻黃堿。乳糖和硫酸銨是Es2發酵產麻黃類生物堿最適宜的碳源和氮源，當碳源30 g/L，氮源4 g/L，pH5.0，溫度30 ℃，發酵8 d時，Es產麻黃類生物堿的產量最高。結論 采用微生物發酵的方法實現麻黃類生物堿的工業化生產，可緩解麻黃堿市場需求對環境的壓力。

麻黃；內生真菌；麻黃類生物堿

植物內生真菌是指其生活史上一定階段生活在活體植物組織內，但對植物組織不引起明顯病害癥狀的真菌[1]。內生真菌可產生與宿主植物相同或具有相似生理活性的代謝產物[2-3]，可能是由于相關基因的直接傳遞，這種傳遞可以發生在寄生生物與寄主或共生生物與寄主之間的相互作用過程中；或者更直接地在共同生活的環境中，經過長期直接接觸而傳遞遺傳物質[4]。

麻黃(EphedrasinicaStapf)，屬于種子植物門、裸子植物亞門、麻黃科、麻黃屬，又名龍沙(《本經》)，卑相、卑鹽(《別錄》)，因其植株色黃而味麻，故名麻黃[5]。麻黃為重要的珍稀藥用植物，含有麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿等麻黃類生物堿，能發汗散寒，宣肺平喘，利水消腫。主治傷寒表實、發熱惡寒、頭痛鼻塞、骨節疼痛、咳嗽氣喘、風水浮腫、小便不利、風邪麻痹和皮膚不仁等癥[6]。近年來，人們陸續從特定功能的藥用植物中分離出類似功能的多種內生真菌[7]。因此，從特定藥理功能的植物中尋找特定活性的內生真菌，已成為尋找新的天然產物的正確研究方向[8]。如果麻黃中的內生真菌能產生與其相同或相似的藥用活性成分，就可以大量培養此真菌，從中分離出藥用成分，便于工業化生產。這可以緩解麻黃類生物堿市場需求對環境的壓力，同時對于植物藥的生產新途徑的開發及環境的保護將具有十分重要的經濟及生態效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材：麻黃草質莖(購買自藥材市場)，請有經驗的藥工鑒定，確認為真品麻黃草質莖。

1.1.2 培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(北京陸橋技術有限責任公司)，霉菌液體培養基、察氏培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)。

1.1.3 試劑：碘化鉍鉀(上海紫一試劑廠)，乙腈(色譜純，德國Merck公司)，磷酸、三氯甲烷、鹽酸、氫氧化鈉(分析純，西垅化工股份有限公司)，麻黃堿、偽麻黃堿和甲基麻黃堿標準品(Sigma公司)

1.1.4 主要儀器設備：LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津)，SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州凈化)，BAO-150A型精密鼓風干燥箱(上海施都凱儀器設備有限公司)，SHZ-82A型數顯氣浴恒溫振蕩器(常州華普達儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理：將麻黃草質莖切成小段，用自來水洗凈，在超凈工作臺上將洗凈、切好的麻黃草質莖用75%的酒精迅速浸泡一下，再移入2%的次氯酸鈉溶液中浸泡20 min，最后用無菌水洗4遍。

1.2.2 內生真菌的分離：將上述處理好的材料接種馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，28 ℃培養5 d后用稀釋涂布平板法和平板劃線分離法進行菌種分離純化。

1.2.3 內生真菌生物堿產生情況的初檢：在超凈工作臺上將菌絲體制成懸液，吸取2 mL菌懸液接種霉菌液體培養基，28 ℃搖床培養5 d，轉速100 r/min。將菌絲體烘干后用研碎成粉末狀，再加入20 mL 80%的酒精，在70 ℃的水浴中提取3 h，蒸去酒精，濃縮液滴加5%鹽酸使成酸性，過濾[9]，濾液滴加1～2滴碘化鉍鉀試劑[10]，若產生桔紅色沉淀為陽性反應。在培養液中分別直接滴加1～2滴碘化鉍鉀試劑，觀察是否為陽性反應。

1.2.4 HPLC分析內生真菌產生的生物堿種類：色譜條件[11]：色譜柱：Intersil ODS-SP C18型色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(3:97)；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流速:1.0 mL/min。

標準儲備液配制：精密稱取經五氧化二磷減壓干燥24 h的麻黃堿對照品10 mg至10 mL容量瓶中，加流動相適量，超聲使溶解，放冷并稀釋至刻度，即得1 mg/mL的對照品儲備液。用流動相將儲備液稀釋為濃度10 μg/mL，0.45 μm微孔濾膜過濾，供進樣用。偽麻黃堿及甲基麻黃堿標準儲備液配制方法同上。

供試樣品制備：將經過1.2.3初檢能產生物堿的真菌分別接種到裝有霉菌液體培養基的三角瓶中(500 mL三角瓶，裝液量為200 mL)，28 ℃搖床培養5 d。菌絲烘干后用研缽研碎成粉末狀，加入菌絲粉末10倍量的0.5%的鹽酸溶液提煮，用10%的NaOH溶液調節pH10～12。再加入 NaCl至飽和，轉入分液漏斗中，加 30 mL等體積的三氯甲烷萃取，靜置4 h。待萃取溶液兩相分層且澄清后取三氯甲烷層。將三氯甲烷層減壓濃縮至干，用10 mL乙腈溶解，再減壓濃縮至干，最后用乙腈溶解，即得HPLC供試樣品液。

1.2.5 麻黃類生物堿濃度檢測[11]：

① 標準曲線繪制：以1.2.4標準儲備液為母液，配制系列濃度：2、5、10、25、50 μg/mL，按照1.2.4中色譜條件進行HPLC分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，分別繪制麻黃堿、偽麻黃堿及甲基麻黃堿標準曲線。供試品溶液，以外標法分別計算麻黃堿、偽麻黃堿及甲基麻黃堿的含量。其麻黃類生物堿含量=麻黃堿含量+偽麻黃堿含量+甲基麻黃堿含量；

② 精密度試驗：取同一份供試品溶液，連續進樣6次，考察色譜峰保留時間和峰面積的一致性；

③ 加樣回收率試驗：取6份已知麻黃堿、偽麻黃堿及甲基麻黃堿含量的供試品溶液，分別準確加入麻黃堿、偽麻黃堿及甲基麻黃堿對照品適量，進樣測定峰面積，計算回收率。

1.2.6 發酵條件的優化：以總麻黃類生物堿產生量為評價指標，以察氏培養基為發酵的基礎培養基，選擇以可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖為碳源，添加量均為25 g/L；以酵母膏、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨、尿素為氮源，添加量均為 3 g/L；以總麻黃類生物堿濃度為評價指標，依次進行Es2發酵培養條件進行單因素試驗。每組實驗重復3次。

以單因素實驗結果為基礎，探索正交設計試驗的最佳發酵條件。選取碳源量、氮源量、pH值、溫度、發酵時間5個考察因素，每個因素選取5個水平，利用DPS軟件設計 L16(45)進行正交試驗(見表1)，確定最佳發酵培養基和發酵條件。

表1 L16(45)正交試驗因素/水平表

2 結果

2.1 內生真菌生物堿產生情況初檢 從麻黃中分離出了12株內生真菌，培養液中均未檢測到生物堿。其中2株內生真菌菌絲體中檢測到有生物堿產生，將這2株內生真菌編號為Es2和Es3。

2.2 HPLC分析內生真菌產生的生物堿種類 標準品、Es2和Es3菌絲體提取物的液相色譜特征圖見圖1、圖2和圖3。在上述色譜條件下，麻黃堿、偽麻黃堿及甲基麻黃堿標準品的保留時間依次為15.395、16.835、19.809 min，Es2菌絲體提取物在15.449、16.835、19.289 min有吸收峰；Es3菌絲體提取物在16.889 min有吸收峰，與標準品的保留時間比較可知：內生真菌Es2可產生麻黃堿、偽麻黃堿及甲基麻黃堿；內生真菌Es3可產生偽麻黃堿。

圖1 麻黃類生物堿標準品液相色譜圖1.麻黃堿;2.偽麻黃堿;3.甲基麻黃堿Fig.1 Liquid chromatogram of ephedra alkaloids standard1. ephedrine;2. pseudoephedrine;3. methephedrine

圖2 Es2菌絲體提取物液相色譜圖1.麻黃堿;2.偽麻黃堿;3.甲基麻黃堿Fig.2 Liquid chromatogram of Es2 mycelium extract1. ephedrine;2. pseudoephedrine;3. methephedrine

圖3 Es3菌絲體提取物液相色譜圖1.偽麻黃堿 Fig.3 Liquid chromatogram of Es3 mycelium extract1. pseudoephedrine

2.3 麻黃類生物堿濃度檢測 標準曲線線性方程為：麻黃堿Y=33808X-850.33，r2=0.9969；偽麻黃堿Y=35681X-768.32，r2=0.9991；甲基麻黃堿Y=46820X-668.82，r2=0.9988，表明3者的濃度與峰面積在2～50 μg/mL范圍內均呈良好的線性關系；

精密度試驗結果：麻黃堿、偽麻黃堿及甲基麻黃堿的峰面積RSD分別為0.8%、1.1%和1.4%；

加標回收率結果：麻黃堿的平均回收率為95.88%，RSD為0.7%；偽麻黃堿的平均回收率為96.24%，RSD為0.8%；甲基麻黃堿的平均回收率為92.35%，RSD為0.8%。

2.4 發酵條件優化實驗結果

2.4.1 單因素實驗結果：內生真菌Es2在不同碳源、氮源培養基上的麻黃類生物堿產生情況見圖4和圖5。不同碳源、氮源均對內生真菌Es2產麻黃類生物堿的影響不同。不同碳源和氮源培養條件下，其麻黃類生物堿產生情況分別為乳糖(42.67±2.52)μg/mL>蔗糖(33.33±3.51 μg/mL>可溶性淀粉(31.33±2.52)μg/mL>葡萄糖(26.33±1.53)μg/mL﹥麥芽糖(20.00±2.00)μg/mL；硫酸銨(56.00±2.00)μg/mL>尿素(52.34±3.51)μg/mL>硝酸鈉(44.00±1.73)μg/mL>蛋白胨(22.67±2.08)μg/mL>酵母膏(19.67±3.06)μg/mL。因此分別選擇乳糖和硫酸銨作為Es2發酵產麻黃類生物堿適宜的碳源和氮源。

圖4 不同碳源對Es2產麻黃類生物堿的影響(n=3)Fig.4 Effect of different carbon sources on the ephedra alkaloids production of Es2(n=3)

圖5 不同氮源對Es2產麻黃類生物堿的影響(n=3)Fig.5 Effect of different nitorgen sources on the ephedra alkaloids production of Es2(n=3)

2.4.2 正交試驗結果：由表2正交試驗結果極差R值可見各因素對Es2發酵產麻黃類生物堿量影響的主次順序是碳源>溫度>氮源>pH>發酵時間。由各因素K值看，當A，B，C，D分別為A3B4C1D3E2時，麻黃類生物堿產量最高。即當碳源30 g/L，氮源4 g/L，pH5.0，溫度30 ℃，發酵8 d時麻黃類生物堿產量最高。

表2 正交試驗結果與分析

3 討論

中國是世界上唯一通過天然植物提取麻黃堿和偽麻黃堿的國家，提取1噸麻黃堿需要消耗掉200～300噸野生麻黃[12]。而麻黃是重要的蓄水保土、防風固沙的灌木植物，對維持荒漠地區脆弱的生態平衡具有顯著作用，野生麻黃資源一旦遭到破壞，則很難恢復。近年來國內外研究者從多種藥用植物中分離出具有產生藥用活性物質能力的內生真菌菌株[13-15]。由于真菌具有易培養、生長快等優點，而且可通過誘變育種等手段提高菌種性能，所以采用微生物發酵的方法實現麻黃類生物堿的工業化生產，可以緩解麻黃堿市場需求對環境的壓力。

本研究從麻黃草質莖中分離出的內生真菌Es2發酵后菌絲體提取物含有麻黃堿、偽麻黃堿及甲基麻黃堿；Es3發酵后菌絲體提取物含有偽麻黃堿。對真菌Es2的發酵條件進行優化，當碳源30 g/L，氮源4 g/L，pH5.0，溫度30 ℃，發酵8 d時麻黃類生物堿產量最高。這2株真菌經過發酵培養后，可以提取出麻黃類生物堿，這對于植物藥的生產新途徑的開發及藥用植物麻黃的保護將具有十分重要的經濟及生態效益。

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(編校：王儼儼)

Research of ephedra endophytic fungi in production of ephedra alkaloids

CAI Jin-zhongΔ, HE Shao-gui, HU Jia

(Department of Science and Technology for Inspection,Xiamen Huaxia University, Xiamen 361024, China)

ObjectiveTo isolate endophytic fungi from the rare medicinal plants ephedra, detect the production of ephedrine alkaloids, and explore the optimum fermentation conditions.MethodsThe endophytic fungi were isolated from the herbaceous stems treated. The ephedrine alkaloids were preliminarily detected by Dragendorff’s reagent. The fungi strains producing ephedrine alkaloids were screened by HPLC method with reference substance of ephedrine, pseudoephedrine and methephedrine. After the optimum carbon source and nitrogen source were determined with total ephedrine alkaloids as evaluation indicators by HPLC, the orthogonal test of L16(45) was designed to investigate five levels of carbon source amount, nitrogen source amount, pH value, temperature, fermentation time.ResultsThe ephedra herbaceous stems endophytic fungus-Es2 mycelium extract after fermentation contained ephedrine, pseudoephedrine and methephedrine. Es3 mycelium extract containing pseudoephedrine after fermentation. Lactose and ammonium sulfate were as the most suitable carbon source and nitrogen source of Es2 fermentation to produce ephedrine alkaloids. Es produced the highest yield of ephedra alkaloids when the carbon source 30 g/L, nitrogen source 4 g/L, pH5.0, temperature 30 ℃, fermented for 8 days.ConclusionThe ephedrine alkaloids of industrial production could be realized by microorganism fermentation method, which has very important significance to alleviate the ephedrine market demand pressure on the environment.

ephedra; endophytic fungi; ephedra alkaloids

蔡盡忠，通信作者，男，本科，講師，研究方向：從事食品、藥品微生物方面的教學和科研工作，E-mail：cjz@hxxy.edu.cn。

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1005-1678(2015)10-0018-04