間充質干細胞治療肝移植術后難治性急性移植物抗宿主病臨床研究

汪國營 唐暉 易慧敏 張英才 易述紅 陳文捷 楊卿 姜楠 傅斌生張琪 楊揚 陳規劃

移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是肝移植術后發生的以發熱、皮疹、腹瀉以及骨髓抑制等為主要表現的全身性免疫疾病，患者最終常因全身感染或骨髓衰竭而死亡。肝移植術后發生GVHD 很罕見，其發生率為0.1% ～0.2%，顯著低于骨髓移植后GVHD 的發生率，但病死率極高，常超過75%［1-2］。由于其發病率極低，目前國內外尚未形成肝移植術后GVHD 統一的診斷標準和治療方案。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新及向間葉細胞起源的各種細胞系分化潛能的非造血系干細胞。MSCs 所具有的低免疫原性和免疫調節特性，為其作為臨床治療免疫相關性疾病提供了可能。目前，無論是自身免疫性疾病還是造血干細胞移植后GVHD 的治療，MSCs都顯示出良好的療效。作為一種新的治療手段，MSCs 治療移植相關的免疫性疾病已受到國內外專家的廣泛關注，也有多個在研的臨床研究［3-4］。本文總結了中山大學附屬第三醫院肝臟移植中心應用MSCs 治療肝移植術后GVHD 的1 例成功經驗，經檢索國內外相關文獻，本文為國際上第1 篇關于MSCs 治療肝癌肝移植后發生GVHD 的研究，現報道如下。

1 臨床資料

患者男性，60 歲，既往有乙型肝炎史18 年，恩替卡韋(博路定)抗病毒治療3 年余。2011 年曾行“脾切除+賁門血管離斷術”。2013 年10 月18 日因“發現肝臟占位性病變7 月余”入院。患者7 個月前因“乙肝肝硬化”復查腹部彩超示:肝硬化聲像，右肝稍小，肝內散在斑片狀低回聲區，較前次超聲檢查明顯增大，考慮小肝癌可能;遂行上腹部MRI示:肝S7/8 段占位病變，考慮為海綿狀血管瘤可能;未予處理。此次入院前10 d 復查甲胎蛋白:4.96 ng/mL;腹部彩超示:肝S4/8 高回聲團較前次檢查明顯增大;上腹部MRI 示:肝S7/8 段占位病變，考慮為原發性塊狀型肝癌，大小約44 mm ×29 mm。入院查體:皮膚、鞏膜輕度黃染，結膜無蒼白，肝掌征陽性，胸前見蜘蛛痣，腹部正中可見一長約15 cm 的陳舊性手術瘢痕，淺表淋巴結未觸及腫大，腹平坦，未見胃腸蠕動波，全腹軟，無壓痛、反跳痛，未觸及腫大膽囊，肝、脾未觸及，移動性濁音陰性。實驗室檢查血常規、肝功能、甲胎蛋白基本正常，乙型肝炎DNA 定量小于100 IU/mL。入院診斷:肝細胞癌、乙肝后肝硬化失代償期、脾切除+賁門血管離斷術后、慢性膽囊炎。

入院后完善相關檢查，排除手術禁忌證后于2013 年10 月31 日在氣管插管全身麻醉下行改良背馱式肝移植術(附加腔靜脈整形)，供受者血型相同。術中見腫瘤大小3.5 cm，術后病理示中分化肝細胞癌，未見脈管內癌栓。術后肝功能恢復順利，免疫抑制方案為糖皮質激素聯合他克莫司。術后19 d患者出現發熱、全身皮疹，并出現白細胞減少癥、口腔潰瘍和腹瀉，但肝功能正常。皮膚活檢病理組織學檢查見淋巴細胞浸潤(見圖1)，免疫組化結果:CMV(-)，特殊染色結果:PAS(-)，六胺銀(-)，抗酸(-)。根據臨床表現、實驗室檢查及皮膚病理組織學結果，診斷為GVHD。給予停用免疫抑制劑、大劑量糖皮質激素沖擊治療、營養支持、大劑量丙種球蛋白等治療后，患者病情無好轉，仍持續發熱，全身皮疹無消退，遂于術后第40 天開始周圍靜脈輸注人臍帶來源的間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，huc-MSCs)治療。

間充質干細胞的臨床應用已通過我院倫理委員會審批。臍帶均來自中山大學附屬第三醫院產科，取自足月妊娠的健康剖宮產婦。產婦術前簽署知情同意書，自愿將胎盤、臍帶等分娩廢棄物交由醫院處理或供科研所用。產婦產前艾滋病病毒抗體、乙肝兩對半、丙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體抗體、支原體等檢測均無異常，確保安全性后方可使用。huc-MSCs 的分離、培養、傳代擴增等過程由中山大學附屬第三醫院生物治療中心完成，huc-MSCs 輸注由生物治療中心輔助完成。

huc-MSCs 治療方案為:細胞數5 ×107/次，每次間隔1 周，共3 次。huc-MSCs 首次輸注3 d 后患者體溫和白細胞即恢復正常，腹瀉好轉，皮疹逐漸消退，口腔潰瘍逐漸好轉。患者無不適及其他并發癥發生，GVHD 獲得完全緩解。患者繼續給予他克莫司+糖皮質激素免疫抑制方案(共停用他克莫司10 d)，于術后55 d 痊愈出院。隨訪至2015 年8 月(20 個月)，未觀察到huc-MSCs 輸注相關不良反應發生，肝、腎功能及甲胎蛋白均在正常參考值范圍內，定期復查肝臟超聲和CT、胸部X 線平片或CT未發現肝癌復發、轉移及新發惡性腫瘤。

圖1 肝移植術后急性移植物抗宿主病患者皮膚活檢病理圖［圖1a (HE×200)，圖1b (HE×400)］

2 討 論

肝移植術后GVHD 主要是因為供肝內免疫細胞被受者的組織相容性抗原激活后增殖分化，引起免疫應答，進而攻擊受者的皮膚、消化道、骨髓等全身器官［1］，患者病情常危重，預后差。其發病機制尚不明確，目前認為其發生需滿足3 個基本條件［5］:(1)供者具有免疫活性細胞;(2)受者擁有供者不具備的組織抗原;(3)受者對供者無免疫反應。由于肝移植術后GVHD 缺乏特異性的臨床表現，早期診斷較為困難。目前主要是根據受累靶器官(皮膚、消化道、骨髓等)癥狀和體征、組織病理學檢查結果以及受者外周血或受累靶器官中存在供者淋巴細胞的證據診斷［6］。本例患者肝移植術后19 d 出現發熱、全身皮疹，并出現白細胞減少癥、口腔潰瘍及腹瀉，結合皮膚活檢病理組織學檢查見淋巴細胞浸潤，可診斷為急性GVHD。

各移植中心目前對肝移植術后GVHD 的治療方案不盡相同，尚未形成統一的規范。目前臨床治療包括:(1)主要通過減少免疫抑制劑，增加受者自身免疫力，可促進清除供者的免疫細胞，減輕組織損傷，并減少發生感染的概率;但同時也存在導致受者發生急性排斥反應的風險，也有報道稱增加或者更換免疫抑制劑能取得良好的效果［7-8］;(2)糖皮質激素是經典的抗炎藥物，大劑量糖皮質激素沖擊治療可中斷炎性因子引起的“瀑布”效應，誘導供者免疫細胞凋亡，改善受者的全身癥狀［9］，但會進一步抑制受者免疫力，增加感染機會［10］;(3)常同時合并使用抗生素預防感染。本例患者在診斷為急性GVHD 后立即停用免疫抑制劑，采用大劑量糖皮質激素及丙種球蛋白沖擊治療，并加強抗感染治療;但效果不佳，患者病情無好轉，仍持續發熱，全身皮疹無消退，靶器官損傷無明顯改善。這使得我們必須尋求另一種有效的治療方法。

MSCs 可由骨髓、脂肪組織、胎肝及臍帶血中分離得到，能抑制各種免疫細胞活性，包括T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、DC 細胞及NK 細胞等。MSCs 的低免疫原性及免疫調節性等免疫學特性為其臨床治療GVHD 提供了可能。2004 年，Le Blanc 等［11］首次嘗試用MSCs 治療1 例糖皮質激素耐藥的Ⅳ度腸道和肝臟急性GVHD 患者，療效顯著。隨后，多個移植中心相繼應用MSCs 治療GVHD。Introna 等［12］用MSCs 治療40 例糖皮質激素耐藥的GVHD 患者，有效率為67.5%，其中完全緩解為27.5%;此外，研究還發現Ⅱ級GVHD 患者的完全緩解率高于Ⅱ級以上患者，兒童患者的完全緩解率高于成人患者，1 年和2 年的總生存率分別為50.0%和38.6%。國內有研究報道12 例糖皮質激素耐藥的慢性GVHD 患者，在原有免疫抑制劑基礎上聯合MSCs 輸注，3 例獲得完全緩解，6 例獲得部分緩解，總有效率為75%［13］。

然而，MSCs 究竟是促進腫瘤進展還是抑制其生長有不同的報道［14］，MSCs 是否會促進肝癌肝移植后的肝癌復發仍不清楚，因而限制了其在肝癌肝移植術后發生GVHD 患者中的應用。MSCs 有助于腫瘤的轉化、腫瘤血管生成和腫瘤細胞的遷移，具有向組織損傷、炎癥部位、腫瘤組織的歸巢能力，與多種腫瘤增殖及侵襲相關。在炎癥微環境下，MSCs 可通過TGF-β 信號途徑誘導上皮間質轉化，從而促進肝癌轉移［15］。而通過上調血管內皮生長因子表達，MSCs 可促進肝大部分切除術后肝細胞再生，更加表明MSCs 歸巢能力與肝細胞增殖再生能力的密切關系［16-17］。但MSCs 與肝癌切除術后以及與肝癌肝移植術后的肝癌復發關系如何目前未見報道。

本病例在使用常規方法治療肝移植術后GVHD無效的情況下，及時采用huc-MSCs 作為挽救性治療措施，取得了較好的療效，患者無明顯并發癥發生，GVHD 獲得完全緩解。隨訪20 個月未觀察到huc-MSCs 輸注相關的不良反應發生，未發現肝癌復發和huc-MSCs 相關的惡性腫瘤發生。說明MSCs在治療肝移植術后GVHD 中有著良好的應用前景，可作為難治性GVHD 的一種挽救生命的手段，但仍需進一步臨床研究來證實其安全性，也需要免疫抑制狀態下MSCs 對肝癌影響的基礎研究。檢索國內外文獻，本例為國際上第1 篇關于MSCs 治療肝癌肝移植后發生GVHD 的臨床報道。

3 總 結

GVHD 是肝移植術后罕見的并發癥，死亡率高，但由于臨床病例少，缺乏系統性研究，臨床上主要依靠經驗性的診斷和治療，尚缺乏統一的規范和標準。MSCs 由于其特有的免疫調節功能，已初步被用于治療移植后出現的難治性GVHD，并有一定的療效。但其是否與肝癌等惡性腫瘤的復發有關，目前仍難以做出結論，可作為肝移植后難治性GVHD 的一種挽救生命的手段，但其安全性仍需進一步研究。另外，MSCs 治療肝移植后GVHD 的輸注細胞數、輸注次數以及療程等問題還需要深入研究。

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