甲強龍對神經元機械損傷后相關凋亡因子表達的影響

姚年偉，徐峰，康輝，施立奇，蔡賢華*

(1.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065；2.廣州軍區武漢總醫院骨科，湖北 武漢 430070；3.余姚市中醫醫院骨傷科，浙江 寧波 315400)

實驗研究

甲強龍對神經元機械損傷后相關凋亡因子表達的影響

姚年偉1，2，徐峰2，康輝2，施立奇3，蔡賢華2*

(1.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065；2.廣州軍區武漢總醫院骨科，湖北 武漢 430070；3.余姚市中醫醫院骨傷科，浙江 寧波 315400)

目的 研究甲強龍對體外培養的大鼠脊髓神經元損傷后的相關凋亡因子表達的影響。方法 通過星形膠質細胞和神經元共培養的方法建立神經元體外培養模型，將模型分為對照組：正常的神經元培養，損傷組：用機械切割的方法造成神經元的損傷模型，甲強龍組：運用1 μM的甲強龍藥物干預神經元機械損傷模型，對比各組24 h后凋亡相關因子的表達變化。結果 與空白對照組相比較，神經元損傷組caspase-3、caspase-3mRNA和Bax表達升高，Bcl-2/Bax的比率和Bcl-2的表達降低(P<0.05)；與損傷對照組相比較，甲強龍組caspase-3、caspase-3mRNA和Bax表達降低(P<0.05)，Bcl-2的表達和Bcl-2/Bax的比率升高(P<0.05)。結論 甲強龍能降低神經元機械性損傷后caspase-3凋亡因子的表達，升高Bcl-2/Bax的比例，抑制神經元的凋亡過程，保護神經元。

急性脊髓損傷；甲強龍；神經元；機械損傷；凋亡因子

急性脊髓損傷(acute spinal cord injury，ASCI)是一種高能量、中樞神經系統損傷嚴重的疾病，損傷后易導致肢體癱瘓，嚴重影響患者及家庭的生活質量。中樞神經系統損傷和疾病后修復的失敗包括多個因素：神經細胞的凋亡，軸突再生障礙和缺血再灌注損傷等。動物實驗[1]研究證實脊髓損傷后局部組織內的凋亡因子caspase-3、Bax和Bcl-2的表達量發生變化。caspase-3的表達量升高意味著神經細胞凋亡增多，而Bcl-2/Bax的比例也調控著細胞的凋亡過程。我們運用星形膠質細胞作為滋養層，獲取體外培養的神經元，從細胞水平研究神經元機械性損傷后神經元相關凋亡因子的表達，觀察甲強龍對相關凋亡因子表達的影響。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物和器材試劑 新生1 d的SD大鼠(購于武漢大學實驗動物中心)、解剖顯微鏡、離心機、倒置熒光顯微鏡、DMEM/F12培養液(Hyclone，美國)、PBS緩沖液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(四季青，杭州)、多聚賴氨酸(poly-L-Lysine，PLL)(sigma，美國)、DNaseI酶、雙抗、0.25%胰酶(Hyclone，美國)、谷氨酰胺、B27神經生長因子(Gibco，美國)、Neurobasal培養液(Gibco，美國)、甲強龍(輝瑞公司，美國)等。

1.2 溶液的配制 組織緩沖液100 mL：10 mL D-Hank′s+1 mL HEPES溶液+1 mL雙抗+88 mL DMEM/F12培養液，膠質細胞培養液100 mL：10 mL FBS+1 mL雙抗+89 mL DMEM/F12培養液，神經元培養液：2 mL B27神經生長因子+1 mL 5 mmol/L谷氨酰胺溶液+97 mL Neurobasal培養液。

1.3 PLL包被培養器皿和圓形蓋玻片 于使用前1天向培養板內或圓形蓋玻片表面滴加入0.01 mg/mL濃度的PLL，使其覆蓋容器底部，放入細胞培養箱內過夜，第2天回收多聚賴氨酸溶液，PBS緩沖液沖洗培養瓶底3 次，晾干備用。

1.4 脊髓神經元與星形膠質細胞共培養體系的建立

1.4.1 星形膠質細胞的分離與培養 取2只新生24 h內的SD大鼠，在冰塊上無菌條件下取出大腦并放置于培養皿內，加入3 mL含預冷的膠質細胞培養液，在解剖顯微鏡下仔細剔除皮質表面的腦膜及血管。取大腦皮質放入另一培養皿內，將其剪成1 mm3左右大小的碎塊，向培養皿內滴加2 mL 0.25%的胰酶溶液和200 μL DNaseI酶。晃勻后放入37℃恒溫培養箱內，消化15～20 min，期間每5 min左右震蕩搖晃1次。后將消化液及未消化的皮質組織移至15 mL離心管內，用巴斯吸管緩慢吹打8～10 次，200 g離心5 min，棄上清，加入膠質細胞培養液3 mL，用巴斯吸管吹打15～20次后靜置1 min，將上清液移至另一15 mL離心管內，再向剩余未消化的皮質組織內加入3 mL膠質細胞培養液，重復上述操作，直至離心管內無肉眼可見的組織塊。將細胞懸液經200目濾網過濾后，200 g離心5 min，棄上清，加入10 mL膠質培養液重懸細胞，計數板計數后以3×106/瓶密度接種于多聚賴氨酸包被的T75培養瓶內，補充培養液至15 mL。12 h后換液，以后每3天換液一次。在細胞鋪滿培養瓶底約80%面積時進行傳代操作，傳代3 次后以1×105/瓶的密度接種于多聚賴氨酸包被的6 孔培養板內，在與神經元共培養前1天將培養液換成神經元培養液。

1.4.2 脊髓神經元的分離與培養 取2 只新生SD大鼠，同取星形膠質細胞處理相同，將大鼠全脊柱取出放入預冷組織緩沖液的培養皿內，解剖顯微鏡下剪斷椎板，后將脊髓完整取出放入預冷的組織緩沖液的培養皿內。小心地將硬脊膜剝離，將脊髓組織剪成1 mm3大小的組織塊，消化方法同星形膠質細胞。將收集的脊髓神經細胞懸液接種于PLL包被的T75培養皿內30 min，讓膠質細胞和成纖維細胞貼壁，后重新收集未貼壁的細胞，再次200 g離心5 min后重新懸浮細胞計數，接種于PLL包被的直徑22 mm的蓋玻片上。

1.4.3 共培養體系的建立 待神經元牢固貼壁于圓形蓋玻片后將圓形蓋玻片覆蓋于星形膠質細胞的培養孔內的支架上，并換用神經元培養液，每天用倒置顯微鏡觀察神經細胞的生長狀況。

1.5 損傷模型制作與實驗的分組

損傷模型的制作參考Boomkamp等[2]的方法，運用15號手術刀片作為工具，在鋪有神經元的蓋玻片上做劃痕損傷，間距均為1 mm，縱橫方向均做劃痕損傷。實驗分為空白對照組：神經元不損傷也不加藥物干預，其余的培養條件與以下各組相同；損傷對照組：神經元只作損傷不加藥物干預；甲強龍組：在損傷的同時給予1 uM的甲強龍藥物干預。在損傷及藥物干預24 h后進行各項指標的檢測。

1.6 脊髓神經神經元的βⅢ-tubulin抗體熒光染色法

在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3 次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3 次，每次3 min；在爬片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，每張爬片滴加足夠量的稀釋好的一抗(βⅢ-Tubulin)并放入濕盒，4℃孵育過夜；過夜后PBST緩沖液(phosphate buffered saline with tween-20)浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光(Cy3)標記羊抗小鼠IgG，濕盒中20～37℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3 次，每次3 min。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7 定量RT-PCR檢測Caspase-3mRNA的表達

收集細胞，加入1 mL Trizol裂解液和200 μL氯仿，顛倒數次混勻，室溫放置5 min。4℃下12 000 rpm離心15 min，轉上層水相于新的1.5 mL EP管中，加入等量的異丙醇混勻，室溫靜置10 min。4℃下12 000 rpm再次離心15 min，棄上清，沉淀用預冷的70%無水乙醇洗3次，空氣干燥5～10 min，溶于20 μL DEPC水中，然后將dNTP加入其中，于42℃溫箱內孵育60 min，最后將上述樣品置于70℃溫箱內處理5 min滅活逆轉錄酶，進行逆轉錄反應。逆轉錄反應條件：起始溫度為50℃，持續2 min，后95℃持續10 min，循環1次；變性溫度95℃，持續30 s；退火溫度60℃，持續30 s，循環40 次。然后進行解離程序，分別在95℃持續15 s，60℃持續1 min，95℃持續15 s，循環1 次。引物設計如下：β-actin上游：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，擴增片段長度為240bP；Rat caspase-3上游：5′-TGGAATGTCAGCTCGCAATG-3′，下游：5′-AGGTCCGTTCGTTCCAAAA-3′，擴增片段長度為224 bP。目的基因mRNA相對表達量=2-ΔΔCt。

1.8 Western Blot檢測Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達

取適量已加PMSF的RIPA裂解液勻漿細胞，測蛋白濃度后，各樣品取35 μg總蛋白上樣電泳，根據蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳。根據預染marker顯示，判斷目的蛋白得到充分分離后，停止電泳。轉膜后用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h。用封閉液稀釋相應的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜5～6 次，5 min/次。用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗(1︰50 000稀釋)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫搖床孵育2 h。TBST充分洗滌PVDF膜5～6 次，5 min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育數分鐘。待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X線膠片壓片后依次放入顯影液顯影，定影液定影，顯色曝光。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 細胞培養形態的一般觀察 原代星形膠質細胞在接種后約4 h即可貼壁，胞體呈圓形，1 d后換液可見細胞貼壁較緊密，胞核不清晰，細胞胞體向周圍伸展，突起粗大，胞體扁平，呈“碎布塊”樣，形態不規則，表面附有神經元、少突膠質細胞等。經傳代、純化后，貼壁的星形膠質細胞在融合約70%時可用于接種神經元。消化后的神經元剛呈圓形，透光性強，體積較小，多數神經元在接種后1 d貼附于圓形蓋玻片上，貼壁后的神經元呈圓形或橢圓形，胞體突起，可見部分神經突起形成。貼壁后神經元的突起逐漸增多、延長，相互之間交織成網狀。體外培養的神經元在5～7 d時生長旺盛，胞體豐滿，胞核清晰可見，細胞透光性強，呈圓形或橢圓形亮點，突起之間接觸密切。培養10 d后神經元狀態逐漸變差，胞體內褐色顆粒增多，突起變細、消失。

2.2 甲強龍對神經元機械損傷后凋亡因子表達的影響 24 h后Western Blot檢測的各項指標情況見表1。與空白對照組相比，神經元機械性損傷24 h后細胞內Bcl-2和Bcl-2/Bax的比例降低，Caspase-3、Bax蛋白及Caspase-3mRNA的表達升高(P<0.05)；與損傷對照組相比，甲強龍干預后機械損傷的神經元內Bcl-2和Bcl-2/Bax的比例升高，Caspase-3、Bax蛋白及Caspase-3mRNA的表達降低(P<0.05)(見圖1～5)。

表1 各組凋亡相關蛋白的相對表達量

圖1 三組BCL-2水平比較

圖2 三組BAX水平比較

圖3 三組Caspase-3水平比較

圖4 三組Bcl-2/Bax水平比較

圖5 三組Caspase-3mRNA水平比較

3 討 論

ASCI的治療及神經功能的恢復一直是醫學難題，脊髓損傷后局部發生復雜的細胞和分子間的相互作用來修復原始的損傷。神經細胞功能的恢復涉及到損傷后炎性細胞的作用，膠質細胞和細胞外基質內的促進和抑制神經功能恢復因子的表達等。越來越多的證據表明中樞神經系統損傷后繼發的代謝毒素的生產，如活性氧、炎性因子和興奮性氨基酸等通過激活凋亡信號[3]和自噬作用[4]加重神經系統的損傷。神經細胞的凋亡過程嚴重影響著神經功能的恢復，抑制脊髓損傷后神經細胞的凋亡過程已成為急性脊髓損傷的一個治療策略。

甲強龍是一種人工合成的糖皮質激素，目前廣泛用于治療各種神經系統疾病包括白質損傷、多發性硬化癥、急性播散性腦脊髓炎和急性脊髓損傷。其作用機理可能歸因于抗炎或抗氧化等性能。甲強龍用于急性脊髓損傷患者，可以減少脊髓組織的氧化應激反應和炎性因子的表達。有研究還認為甲強龍能夠抑制ASCI后自噬相關蛋白LC3的表達，抑制脊髓組織內自噬細胞的激活，減少對神經細胞的損傷[4]。在馬尾神經壓迫的模型內，甲強龍能抑制壓迫局部的神經組織內的促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達，p53上調凋亡調控因子和p53的表達也受到抑制[5]。蔡賢華等[1]用螺釘壓迫法建立家兔頸髓損傷模型，通過甲強龍的沖擊治療后發現甲強龍能夠抑制損傷后caspase-3的表達和升高Bcl-2/Bax mRNA比例，同時能上調超氧化物歧化酶(SOD)的表達，抑制氧化應激反應，保護脊髓神經組織。

甲強龍治療急性脊髓損傷的基礎和臨床研究較多，也有報道研究將其聯合其他技術治療急性脊髓損傷[6]，但對于其治療效果有著不同的學術爭論[7]。Caspase-3是細胞凋亡過程中的標志性蛋白，是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。有研究[8]通過不同時間檢測脊髓損傷模型大鼠的損傷段脊髓組織內的caspase-3陽性染色細胞的比例發現，與對照組相比較甲強龍組的caspase-3陽性細胞更多，但差異無統計學意義，認為甲強龍發揮其保護神經組織的作用機制可能并不包括抗凋亡作用。Lee JM等[9]從體內和體外的實驗中均發現，甲強龍保護的是脊髓損傷后少突膠質細胞，而不是神經元。甲強龍能逆轉氨甲基磷酸誘導的少突膠質細胞內抗凋亡作用的Bcl-x(L)表達的減少和caspase-3激活過程減少少突膠質細胞凋亡，而相同劑量的甲強龍不會提高神經元的存活率。

在本研究中，我們發現甲強龍對機械性損傷的神經元有保護作用。我們利用星形膠質細胞和神經元分層培養技術，建立神經元體外培養模型，此模型模擬了體內神經元的狀態，即在膠質細胞滋養層的作用下對神經元的狀態進行研究，分層培養技術同時也降低了非神經元細胞對實驗結果的干擾。在本研究中，神經元機械性損傷后其細胞內的caspase-3水平和凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達明顯發生改變，與空白對照組比較caspase-3和Bax的水平顯著升高，而Bcl-2的水平則明顯降低，從而促進機械性損傷誘導的神經元凋亡過程，這一現象與馬尾損傷模型和頸髓壓迫模型中的表現相似[1-5]。同時神經元內Bcl-2/Bax蛋白的比例也調節著細胞的凋亡過程[10]，機械損傷的神經元內Bcl-2/Bax蛋白的比例顯著降低，意味著機械損傷后神經元內以促凋亡因子的表達為主。使用甲強龍藥物干預機械性損傷的神經元后，上述結果發生逆轉，Bcl-2蛋白的表達和Bcl-2/Bax蛋白的比例較損傷組明顯提高，caspase-3的水平顯著降低，提示甲強龍能夠在細胞水平顯著抑制神經元機械性損傷后的凋亡過程，從而發揮對神經元的保護作用。

綜上所述，我們認為甲強龍能夠從細胞分子水平發揮對脊髓損傷后神經元的保護作用，為臨床治療急性脊髓損傷提供理論基礎。

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The Influence of Methylprednisolone on the Expression of Apoptosis Cytokine of Neuron after Acute Mechanical Injury

Yao Nianwei1，2，Xu Feng2，Kang Hui2，etal

(1.Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China；2.Department of Orthpedics，Wuhan General Hosptial of Guangzhou Military District，Wuhan 430070，China)

Objective To research the influence of methylprednisolone on the expression of apoptosis cytokine in the cultured rat spinal neuron after actue mechanical injury.Methods Co-culture astrocytes and neurons were prepared in vitro.The astrocytes and neurons were co-cultured in the control group.And we used the scalpel to cut the neuron in order to make the damage model in the injury group：1uM methylprednisolone was mixed in culture solution in the mechanical damage model in the methylprednisolone group.The apoptosis related factors were tested.Compare expression of apoptosis related factor in 3 groups after cells were cultured 24 h.Results In injury control group，compared with sham control group，caspase-3，caspase-3 mRNA and Bax expression significantly increases(P<0.05)，while the ratio of the Bcl-2/Bax and the expression of Bcl-2 lower(P<0.05).The expression of caspase-3，caspase-3 mRNA and Bax were less in methylprednisolone group compared with the injury control group (P<0.05)，while the Bcl-2 expression and the ratio of the Bcl-2/Bax elevated(P<0.05).Conclusion Methylprednisolone can reduce the expression of apoptosis cytokine after neurons mechanical injury，and increase the rate of the Bcl-2/Bax，inhibit the apoptosis process of neurons.

acute spinal cord injury；methylprednisolone；neuron culture；mechanical damage；apoptosis cytokine

全軍醫學科學技術研究“十一五”計劃攻關課題(08G031)；*本文通訊作者：蔡賢華

1008-5572(2015)06-0516-05

R322.7+1

A

2014-11-28

姚年偉(1987- )，男，醫師，湖北中醫藥大學，430065。