骨肉瘤患者血清miR-21的表達意義及其與化療藥物敏感性的研究

吳子晏，劉洋，楊述華

(1.武漢市第五醫院骨科，湖北 武漢 430050；2.武漢協和醫院骨科，湖北 武漢 430022)

臨床研究

骨肉瘤患者血清miR-21的表達意義及其與化療藥物敏感性的研究

吳子晏1，劉洋1，楊述華2

(1.武漢市第五醫院骨科，湖北 武漢 430050；2.武漢協和醫院骨科，湖北 武漢 430022)

目的 本研究通過檢測骨肉瘤患者血清中miR-21的表達水平，分析其在化療前后的變化，研究血清miR-21的表達與化療藥物敏感性之間的關系。方法 應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測38 例骨肉瘤患者(肺部轉移患者17 例)化療前后血清中miR-21的表達水平，分析血清miR-21表達水平與骨肉瘤患者臨床病理特征之間以及與化療藥物敏感性之間的關系。結果 與健康對照組表達量0.23相比，血清miR-21在骨肉瘤患者中的表達量為5.68，表達水平明顯上調(P=0.007)；有肺部轉移的患者血清中miR-21的表達量為7.26，高于無肺部轉移的患者表達量2.32，兩者之間差異有統計學意義(P=0.023)；血清miR-21與對應腫瘤組織miR-21的表達呈正相關(rho=0.712，P<0.001)；而且本研究發現血清miR-21水平在化療無效者為7.65，明顯高于化療有效者2.75，兩者比較差異有統計學意義(P<0.001)。結論 高表達的miR-21水平與骨肉瘤肺轉移存在一定的關聯，血清miR-21表達與骨肉瘤化療療效密切相關，其可以作為潛在的生物標記物用于骨肉瘤早期診斷及化療敏感性預測，且可以作為一個潛在的治療靶點。

骨肉瘤；血清；miR-21；化療敏感性

骨肉瘤是一種常見的骨原發惡性腫瘤，好發于青少年，由于其生長快、病程短、易早期發生肺轉移，危害性大，死亡率高，隨著新型輔助化療和手術治療的開展，其5年存活率已經由不超過20%升至60%以上[1]。但由于化療抵抗的產生和化療藥物的不良反應，骨肉瘤的治療效果仍不盡人意，目前還缺少一種特異標記物，能用于骨肉瘤早期診斷、預后判斷和指導治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 來自華中科技大學協和醫院骨科和腫瘤科2012年4月至2014年2月收治的骨肉瘤患者38 例(肺部轉移患者17 例)，其中男性24 例，女性14 例，年齡14～62 歲(中位年齡25 歲)。均留取手術前化療前后1 d空腹血清標本(化療T12方案，甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑和異環磷酰胺)，腫瘤組織臨床分期參照Enneking分期法。全部病例均經臨床、X線片、病理組織學檢查證實。手術標本用4%的甲醛溶液固定24 h后，按常規石蠟包埋技術進行骨肉瘤石蠟標本的制作，用于病理學觀察和miR-21基因檢測。健康對照組10 例，男性5 例，女性5 例，年齡在11到30 歲之間，平均年齡19 歲。均取空腹血清標本。

1.2 RNA提取和實時定量聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)檢測miR-21的表達 a)組織和血清總RNA提取：嚴格按照TaqMan miRNA Isolation Kit(加拿大Applied Biosystems公司)提取分離試劑盒說明書步驟進行，用核酸蛋白分析儀檢測提取RNA的濃度和純度。OD260/OD280均在1.8～2.0。b)miRNA莖環反轉錄：應用TaqMan microRNA assay和TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(加拿大Applied Biosystems公司)進行逆轉錄反應，反應條件如下：16℃30 min；42℃30 min；85℃5 min。利用TaqMan Universal PCR Master Mix(加拿大Applied Biosystems公司)進行PCR擴增，反應條件如下：95℃10 min；95℃15s；60℃60s擴增40個循環。采用2-△△Ct公式計算miR-21相對表達量[2]，以U6作為內參基因。

1.3 手術前化療后腫瘤組織壞死分級[3]Ⅰ級：腫瘤壞死很少或無壞死，壞死小于等于50%；Ⅱ級：腫瘤部分壞死，大于50%但小于90%，偶見疏松纖維組織增生，仍見區域性存活腫瘤；Ⅲ級：絕大部分區域腫瘤壞死，大于等于90%但小于等于99%，僅見散在存活腫瘤細胞灶；Ⅳ級：100%腫瘤壞死，無存活腫瘤細胞，可見纖維組織增生。Ⅰ級和Ⅱ級可認為化療無效，Ⅲ級和Ⅳ級可認為是化療有效。

1.4 統計分析 應用SPSS16.0統計軟件包對所得的數據進行統計，用Mann-Whitney U檢驗比較了患者年齡，性別，化療反應與腫瘤組織和血清miR-21的表達相關性；用Kruskal-Wallis H檢驗比較了腫瘤位置，Enneking分期與腫瘤組織和血清miR-21的表達相關性，P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清miR-21的表達 血清miR-21在骨肉瘤患者和正常對照組中均有表達，在骨肉瘤患者中miR-21的表達量為5.68，而在正常對照組中表達量為0.23，兩者差異顯著(P<0.001)；且在肺部轉移患者血清中miR-21的表達量為7.26，高于無肺部轉移患者表達量2.32，兩者差異有統計學意義(P=0.023)。

2.2 血清miR-21的表達與患者臨床病例特征的關系 骨肉瘤患者血清miR-21的表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑和Enneking分期無關(P>0.05)(見表1)；且血清miR-21與對應腫瘤組織miR-21的表達呈正相關(rho=0.712，P<0.001)。

2.3 血清miR-21的表達與療效的關系 化療有效組，骨肉瘤患者血清miR-21表達水平由化療前7.65降至化療后的3.14，兩者差異有統計學意義(P<0.05)；化療無效組，骨肉瘤患者血清miR-21表達水平由化療前2.45降至化療后的1.84，兩者無明顯變化(P>0.05)；且化療前化療有效組血清miR-21表達水平與化療無效組差異顯著(P<0.001)。

表1 miR-21的表達和一般臨床病理特征的關系

3 討 論

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發骨惡性腫瘤，很多患者在確診時已出現了肺部轉移，肺部轉移是骨肉瘤患者死亡的一個主要原因，盡管患者5年生存率有明顯的改善，但是近20年，即使經過國際諸多研究機構的大量努力，骨肉瘤生存率依然沒有明顯變化。究其原因骨肉瘤化療后出現多藥耐藥是一個主要因素。多藥耐藥是指腫瘤細胞被一種藥物誘發耐藥后，同時對其他多種結構和作用機制完全不同的藥物產生交叉耐藥的一種現象[4]，這是一個多基因參與的復雜過程。癌細胞對化療藥物的敏感性決定了抗癌的有效性。因此，迫切需要尋找理想的腫瘤標志物提高骨肉瘤患者的早期診斷率，監測患者化療的療效、實時檢測個體化化療相關標志并據此選擇化療方案。

由于循環中腫瘤細胞、血清和血漿均攜帶腫瘤組織信息，為實時個體化檢測提供了新的檢測來源，目前循環miRNA在腫瘤診斷和預后判斷方面已顯示出卓越性能，如Hu等[5]發現血清miR-486、miR-30 d、miR-1和miR-499表達水平能作為肺癌患者預后的一個強有力指標。

miR-21是miRNAs家族中的一員，其不僅與腫瘤發生有關，還可通過作用于多種腫瘤轉移抑制基因影響腫瘤的轉移與侵入。Zhu等[6]證實通過減少miR-21的表達而導致TMPI、PDCD4和maspin表達的上調，從而使得乳腺癌NDA-MB-231細胞向肺部轉移和侵入的概率明顯減少。Wu等[7]發現miR-21在骨肉瘤中高表達，且miR-21通過調控RECK的表達，影響骨肉瘤細胞侵襲和轉移。最近研究已表明miR-21的表達和藥物耐受有一定的關聯。miR-21在乳腺癌阿霉素耐藥細胞中高表達，上調或下調miR-21可影響乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性[8]。Li等[9]發現在惡性神經膠質瘤細胞中過表達的miR-21能導致細胞對多種化療藥物產生耐受，而降低miR-21的能增強細胞的敏感性；Hwang等[10]在回顧性研究miR-21和化療效果及胰腺癌患者預后之間的關系中發現經化療后miR-21低表達的患者有著更高的無瘤生存率，降低miR-21能提高對化療藥物的敏感性。

本研究檢測了38 例骨肉瘤患者及正常對照組血清中的miR-21表達水平，結果顯示血清miR-21表達量明顯高于對照組，提示外周血miR-21可能是一種較好作為骨肉瘤早期診斷有關的腫瘤標記物；此外，miR-21表達與骨肉瘤患者年齡、性別、部位、大小、TNM分期無統計學相關性，但是有肺部轉移患者miR-21的表達水平高于無轉移患者，說明miR-21與腫瘤轉移之間存在一定的相關性。而肺部轉移是骨肉瘤治療失敗和患者死亡的一個重要原因。Yuan等[11]研究也證實血漿miR-21與骨肉瘤患者生存率之間存在明顯關聯。在腫瘤組織中miR-21的表達和血清中的表達成正相關，提示血清miR-21的表達水平在一定程度上能反映腫瘤組織中的表達水平。而且本研究發現血清miR-21水平在化療無效者明顯低于化療有效者，兩者比較差異有統計學意義，說明血清miR-21水平可能與化療敏感性相關。Asaga等[12]發現在乳腺癌患者中血清miR-21可以作為一個潛在的診斷和預后指標；Wang等[13]研究證實血清miR-21表達越高的非小細胞肺癌患者有著更高淋巴結轉移風險和更短生存期；在前列腺癌中，血清miR-21被發現可以作為多西他賽藥物化療敏感的一個指標[14]。下一步我們將深入探索化療抵抗的一些具體機制，并聯合檢測其他相關的一些miR，以期發現更多血清腫瘤分子標記物在骨肉瘤診斷中的作用及與化療藥物敏感性的聯系。

綜上所述，高表達的miR-21水平與骨肉瘤肺轉移存在一定的關聯，血清miR-21表達與骨肉瘤化療療效密切相關，其可以作為潛在的生物標記物用于骨肉瘤早期診斷及化療敏感性預測，且可以作為一個潛在的治療靶點。

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Serum miR-21 Expression and Its Correlation with Chemosensitivity in Osteosarcoma

Wu Ziyan1，Liu Yang1，Yang Shuhua2

(1.Department of Orthopaedics，Fifth Hospital of Wuhan；2.Department of Orthopaedics，Union Hospital of Wuhan，430050，China)

Objective To investigate the correlation between serum miR-21 and chemosensitivity by detecting the expression of serum miR-21 of patients with osteosarcoma and analyze its change before and after chemotherapy.Methods We examed the level of serum miR-21 expression in 38 osteosarcoma patients(17 patients with lung metastasis)before and after chemotherapy by real-time RT-PCR and evaluated the clinical relevance and the correlation between chemosensitivity and miR-21.Results The expression level of serum miR-21 was higher in osteosarcoma patients(5.68)than in healthy people(0.23)(P=0.007)and the expression of miR-21 in lung metastasis patients(7.26)increased obviously compare to non-lung metastasis(2.32)(P=0.023).And the expression of serum miR-21 was closely correlated with corresponding miR-21 mRNA level in osteosarcoma tissues.Moreover，the expression of serum miR-21 was higher in non-effective chemotherapy samples(7.65)than that in effective chemotherapy samples(2.75)(P<0.001).Conclusion High expression of miR-21 correlates with lung metastasis and chemosensitivity in osteosarcoma patients.miR-21 in the peripheral blood may be used to diagnose osteosarcoma early and predict the chemosensitivity as a potential biomarker and miR-21 may be a potential therapeutical target for osteosarcoma patients.

osteosarcoma；serum；miR-21；chernosensitivity

武漢市衛計委課題(WX13C34)

1008-5572(2015)07-0607-04

R73-3

A

2014-12-31

吳子晏(1978- )，男，主治醫師，武漢市第五醫院骨科，430050。