接種量與通氣比對印楝懸浮細胞生長及印楝素產量的影響

張云竹，鐘秋平

（海南大學 食品學院，海南 海口570228）

印楝素是印楝植物組織細胞產生的一種次級代謝產物[1]，具有高效殺蟲、拒食、抑制生長發育、胃毒、忌避、抑制呼吸、抑制昆蟲激素分泌、降低昆蟲生育能力及殺滅微生物的作用[2－6]，已在農業、醫藥、環保、化妝品及食品中廣泛應用[7－8]。由于印楝素應用范圍廣，高效低毒，是新一代最具有開發價值的生物農藥及食品防腐劑，具有廣闊應用前景[9]。植物中印楝素含量低，種子中含量最高，也僅0.3%左右[10]。為了開發利用印楝素，需要通過植物純化或者人工合成[11－12]得到印楝素。植物純化存在植材耗量大、得率低等缺點，人工合成存在耗時長，得率僅0.000 15%[13]，在實際生產中難以實現，因而不具備現實意義。

通過植物細胞懸浮培養生產次生代謝產物是目前活性物質生產中的一條重要途徑，經此途徑得到的目標產物與原植株相比具有產出速度快、產量高，生產環境條件易控制，可周年生產等[14]。印楝懸浮細胞擴大培養的目的是為了得到大量的印楝素，是其工業化生產的基礎，而生物反應器是實現這一步的前提條件之一。生物反應器相對搖瓶而言，工作體積大，單位生產能力高，可以更好地控制反應系統；生物反應器可以放大，能應用于大規模生產。而國內相應的研究主要集中在印楝素的提取分離、作用效果、作用機制等方面，梁軍等[15]對印楝細胞懸浮培養系的建立及懸浮培養條件進行了研究，但未見對其組織細胞擴大培養方面的研究報道。為此，筆者等探索接種量與通氣比對印楝懸浮細胞生長及印楝素產量影響，以期為印楝懸浮細胞擴大培養提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 印楝懸浮細胞 印楝懸浮細胞，來自于印楝籽源經固體培養基多次繼代誘導培養產生的生長旺盛、色澤嫩黃、疏松易碎的組織，接種于種子培養基。將續代穩定的印楝懸浮細胞按一定接種量轉入500mL三角瓶，25℃培養8d后，得到足量的生長旺盛的印楝懸浮細胞作為種子細胞。

1.1.2 發酵設備和藥品 發酵罐為5L 氣升式發酵罐，上海寶興生物設備工程有限公司；所有藥品均為分析純。

1.1.3 培養基

1） 種 子 培 養 基。 培 養 基 為 MS ＋BA2.0mg／L＋蔗糖40g／L，pH 6.0。2）發酵培養基。培養基為MS＋BA 2.0 mg／L＋蔗糖40g／L，pH6.0，發酵至第8天加入已優化的組合誘導子（水楊酸92.00 mg／L、萘 乙 酸6.0 mg／L、殼 聚 糖54.0mg／L和吲哚丁酸3.0mg／L）。

1.2 培養方法

發酵罐反應器經空罐消毒后，裝入3L 發酵培養基，調節pH 6.0，經消毒后接入一定量的印楝懸浮細胞種子液。培養期間通入一定量的無菌空氣，保持溫度（25±2）℃，黑暗培養。

1.3 細胞干重測定

將培養好的細胞懸浮液，搖勻后取100 mL，3 000r／min離心20 min，沉淀用蒸餾水清洗2次，50℃烘干至恒重后稱量，即為細胞干質量，生長速率以g DW／（L·d）表示。

1.4 印楝素的提取與測定

參照文獻[15]的方法用甲醇萃取干細胞中的印楝素。萃取液用0.45 μm 濾膜過濾，清液采用HPLC法檢測樣品中印楝素的含量。色譜條件：C－18柱，乙腈∶水（10∶90）為流動相，流速0.5mL／min，檢測波長214nm，柱溫30℃。以1g干愈傷組織中印楝素（mg）表示印楝素含量，產量以mg／L 表示，比產率以mg／（g·d）表示。

1.5 數據處理

數據統計分析采用SPSS 與Design Expert 8.0.6統計軟件進行。

2 結果與分析

2.1 接種量與通氣比對印楝懸浮細胞生長和印楝素產量的影響

從表中看出，當固定通氣比為0.2vvm，不同接種量條件下印楝懸浮細胞生長和印楝素合成的變化情況。當接種量為20～60g FW／L時，印楝懸浮細胞的生長速率和印楝素的比產率隨接種量的增大而增大，接種量為60g FW／L 時達最大，分別為0.75 g DW／（L·d）和0.55mg／（g·d）；當接種量達80g FW／L時，印楝懸浮細胞的生長速率和印楝素的比產率又開始下降，細胞干重和印楝素含量降低。因此，綜合考慮細胞生長和印楝素的累積，接種量為60g FW／L較適宜。

從表中還可知，當接種量為60g／L 時，不同通氣比條件下，細胞生長和印楝素的累積隨通氣比的增大呈先升后降的趨勢。當通氣比為0.20vvm時，細胞生長量最大和印楝素積累量最多，分別為11.41g DW／L 和8.32 mg／g；當繼續增大通氣比時，細胞生長受到抑制，印楝素累積降低。因此，適宜的通氣比為0.2vvm。

表 不同接種量與通氣比條件下印楝懸浮細胞的生長狀況與印楝素的產量Table Growth of A.indicasuspension cell and azadirachin yield under different inoculum size and compression－ventilation ratio

2.2 發酵過程中培養基pH 變化及加入誘導子后的印楝素產量

從圖1看出，接種量60g／L、通氣比為0.2vvm時，發酵過程中培養基的pH 呈先降后升的變化趨勢。在發酵9d左右達最低值。可能是隨著發酵時間的進行，培養基中的糖被利用，產生有機酸，使pH 值降低；隨著發酵時間的進一步延長，pH 又逐漸回升，可能與后期產生的一些堿性物質有關。整個發酵期間，pH 變化范圍在4.8～6.4。

從圖1還可知，加入誘導子2d內，隨著發酵時間的延長印楝素累積量逐漸增加，在誘導子加入后48h，印楝素累積量達最大，為8.32 mg／g，此后隨著發酵時間的進一步延長，印楝素累積量略有下降，但降幅很小。

2.4 發酵過程中細胞的生長動態及印楝素的產量變化

從圖2可知，在發酵過程中印楝懸浮細胞生長基本呈S型曲線。與搖瓶發酵相比，印楝懸浮細胞在發酵罐中的生長略差，在培養9d 時為搖瓶的90%左右，可能的原因是在發酵罐中的條件還沒有達到最佳狀態，特別是光照，與搖瓶培養存在差異。糖類物質消耗，發酵罐中印楝懸浮細胞對糖類物質的利用并不完全，在發酵結束時培養基中未被利用的蔗糖為0.8%～1.0%。可見，在發酵罐培養時可以適當降低糖類物質的濃度。添加復合誘導子的細胞生長與底物消耗與對照相比，在誘導子加入后略有差異（P＞0.05）。從圖2還可知，在細胞生長指數期的末期（第8天）添加復合誘導子，印楝素的積累效果極顯著。添加誘導子的24h后印楝素產量最，達94.78mg／L，與對照相比差異達極顯著水平（P＜0.01）。

圖1 發酵過程中培養基的pH 變化及加入誘導子后印楝素的產量Fig.1 Azadirachin yield of pH variation and inductor during the fermentation process

圖2 發酵過程中細胞生長動態及印楝素的產量Fig.2 Growth dynamic and azadirachtin yield of A.indica suspension cells during the fermentation process

3 結論與討論

1）接種量和通氣比是影響發酵罐中懸浮細胞生長和產物積累最重要的2個因素。接種量過小，不能充分利用發酵液中的有效成分，在相同的發酵時間內，細胞增量小，要達到最大生長量，會延長發酵時間，降低設備的利用率。接種量過大，細胞競爭有限的營養成分，對懸浮細胞的生長不利；通氣比大小影響發酵液的傳質和傳熱。通氣比低，發酵液的傳熱傳質效果不好，影響懸浮細胞對營養物質的吸收和利用，從而影響懸浮細胞的生長和印楝素的合成；通氣比過大，容易導致細胞損傷，進而影響細胞生長量和印楝素的合成。

2）在細胞生長的不同時期加入誘導子對產物的積累效果不同。細胞培養時期一般包括延遲期、指數期和穩定期3個時期，不同時期加入刺激劑誘導效果不同。Cu2＋對紅豆杉懸浮培養細胞中紫杉醇形成的影響最大的是生長指數期末期，在指數生長期末紅豆杉培養細胞對Cu2＋誘導處理具有最強的反應能力[16]。研究發現，水楊酸、萘乙酸、殼聚糖和吲哚丁酸組合的復合誘導子對印楝素的積累具有顯著效果，且最適添加時期為細胞的指數生長期末期（另文發表）。誘導子刺激細胞合成最大目的產物所需要的時間各不相同，有的時間較長，有的時間較短[17]。本研究加入復合誘導子后獲得最大印楝素含量所需的時間為48h，與Prakash等人[18]在3L的生化發酵罐中利用復合誘導子誘導印楝懸浮細胞積累最大量印楝素所需時間一致。

3）通過5L 氣升式發酵罐研究印楝懸浮細胞初步擴大培養，探明了適宜的接種量和通氣比分別為60g／L和0.2vvm，在此條件下，懸浮培養基質中的pH 變化呈先降后升趨勢，細胞干重和印楝素產量分別為11.41g DW／L 和8.32 mg／g，添加復合誘導子后24h，印楝素產量最大值（94.78 mg／L）。在反應器中，印楝懸浮細胞生長和印楝素產量呈偶聯型。

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