SDF-1α通過p38MAPK-HIF-1α通路加強卵巢癌細胞轉移的機制探討

薛寶瑤，趙 靜，張西愿，姜 霞，周 卓，于月成

(第四軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安710032)

SDF-1α通過p38MAPK-HIF-1α通路加強卵巢癌細胞轉移的機制探討

薛寶瑤，趙 靜，張西愿，姜 霞，周 卓，于月成

(第四軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安710032)

目的 明確缺氧誘導因子-lα(HIF-1α)在基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)調控的卵巢癌細胞遷移中的作用及其機制。方法 采用免疫組化分析HIF-1α在卵巢癌組織中的表達水平；將HIF-1α siRNA轉染SKOV3卵巢癌細胞，分別用SDF-1α和SDF-1α+SB203580處理，用RT-PCR及western blotting分析HIF-1α、p38MAPK的表達水平。結果 免疫組化分析表明，HIF-1α在卵巢癌組織中高表達，同時SDF-1α可明顯誘導HIF-1α的mRNA及蛋白水平的表達；當用HIF-1α siRNA轉染后，細胞中HIF-1α的表達水平明顯下降。當用通路抑制劑SB203580處理后，SDF-1α誘導的HIF-1α水平明顯降低。結論 SDF-1α可通過p38MAPK-HIF-1α通路來調控卵巢癌細胞的遷移。因此，該研究將為卵巢癌的防治提供新的研究方向。

基質細胞衍生因子-1α；絲裂原活化蛋白激酶通路；缺氧誘導因子-lα；卵巢癌；細胞遷移

基質細胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1 alpha，SDF-1α)(趨化因子CXCL12)在腫瘤的發病機制中起著重要的作用，然而其具體的機制仍然不明。缺氧誘導因子-lα(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)被認為在參與腫瘤發生、發展等生物學方面起到重要作用，其源于HIF-1α上調了SDF-1α表達促進了干細胞黏附、遷移[1]。本研究主要觀察和分析SDF-1α激活PI3K/AKT和MAPK通路促進HIF-1α的表達，從而促進卵巢癌細胞的轉移，明確卵巢癌轉移機制，有望為卵巢癌的靶向治療提供新思路及臨床指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細胞SKOV3由第四軍醫大學細胞工程中心提供，McCoy’5A培養基購自Gibic；兔抗人HIF-lα多克降抗體、兔抗人p38、pp38多克隆抗體、SB203580購自美國Santa cruz公司，兔抗人β-actin抗體購自上海生工生物工程有限公司，DAB顯色劑(棕色)購自福州邁新生物技術開發有限公司；脂質體LipofeetamineTM 2000購自Invitroge，HIF-1α基因干擾片段由大連寶生物工程有限公司設計合成；TRIzol試劑、real-time RT-PCR試劑盒購自TaKaRa，HIF-1α mRNA引物由Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理

將人卵巢癌細胞SKOV3置于含10%胎牛血清McCoy’5A培養基，37℃以及含有5%CO2的環境中培養，分為3組：A組卵巢癌細胞control，B組卵巢癌細胞加入外源SDF-1α，C組細胞轉染HIF-1α siRNA或細胞培養基中加入SB203580。

1.2.2 免疫組化染色

收集第四軍醫大學西京醫院病理科卵巢癌患者石蠟組織塊，制備切片，將石蠟切片常規脫蠟水化，3%過氧化氫滅活內源性過氧化酶20min，枸櫞酸鈉煮沸修復抗原20min，加入兔抗人SDF-1α單克隆抗體、兔抗人HIF-1α單克隆抗體(1:200、4℃、過夜)，PBS洗片后二抗封閉40min，鏈霉親和素-過氧化物酶封閉40min，DAB顯色，蘇木素襯染、脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 缺氧誘導因子-1α沉默RNA轉染

調整濃度SKOV3細胞(8～10)×104/L接種至6孔板，在含10%胎牛血清的McCoy’5A培養基中培養24h，細胞匯合度達到90%～95%。將稀釋好的HIF-1α siRNA和Lipofeetamine 2000試劑混合，形成HIF-1α siRNA/Lipofectamine 2000復合物。將HIF-1αsiRNA轉染載體加到含有細胞和培養基的培養板孔中融合，然后放入37℃、5%CO2培養箱培養。6h后換含10%胎牛血清的McCoy’5A培養基，20h恢復生長后，轉染空白質粒Lipofeetamine 2000組作為對照，利用Western Blot檢測轉染效率。

1.2.4 實時熒光定量逆轉錄多聚酶鏈反應檢測

TRIzol法提取6孔板內各組細胞的總RNA并定量；各樣本取3ng～3g總RNA，按TaKaRa公司試劑盒說明進行逆轉錄合成eDNA。應用實時熒光定量RT-PCR檢測，β-actin作為內參照。PCR引物：HIF-1α正義鏈5-TTGCTCAT￣CAGTT￣GCCACTTCC-3，反義鏈5-AGCAATTCATCTGT￣GCTTTCATGTC-3。具體實驗過程參考TaKaRa公司的real-time RT-PCR試劑盒進行。

1.2.5 蛋白印跡法檢測

將細胞懸液經離心、純化，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，勻漿中的各種成分會在凝膠中分開。之后，將凝膠中的蛋白質轉移到PVDF (polyvinylidene difluoride)膜上，加入第一抗體，孵育24h后，再加入第二抗體，后加入ECL (enhancer chemiluminescence)加強發光反應。最后，將“膜”與X線片相重疊，反應發出的光就會使X線片曝光，沖洗后可見所選擇蛋白所在的位置。通過蛋白印跡法檢測細胞中p38/pp38以及HIF-1α的表達水平。

2 結果

2.1 缺氧誘導因子-1α在上皮性卵巢癌組織中的表達水平

免疫組化分析表明，HIF-1α在9例正常卵巢中無陽性表達，陽性表達率為0；HIF-1α在97例卵巢癌患者組織中65例呈陽性表達，陽性表達率為67.0%,HIF-1α在上皮性卵巢癌中的表達見圖1A、圖1B。

2.2 基質細胞衍生因子-1α誘導缺氧誘導因子-1α的表達

RT-PCR分析表明，SDF-1α刺激后可明顯誘導人卵巢癌細胞SKOV3中HIF-1α的mRNA水平，見圖2，表明SDF-1α能夠促使卵巢癌細胞表達HIF-1α。

2.3 缺氧誘導因子-1α沉默RNA轉染對細胞中缺氧誘導因子-1α表達水平的影響

Western blotting分析表明，HIF-1α siRNA轉染后細胞中HIF-1α的蛋白水平明顯下降，見圖3，提示成功構建HIF-1α沉默的細胞模型。

圖1A 圖1B

注：圖1A為陰性對照(SP×400)；圖1B為HIF-1α在卵巢癌患者組織中的陽性表達(SP×400)。

圖1 缺氧誘導因子-1α在上皮性卵巢癌中的表達

Fig.1 Expression of HIF-1α in ovarian cancer

圖2A 圖2B

注：圖2A為每組中20ng/mL SDF-1α 0、2、4、6和8h后各組中HIF-1α的mRNA水平；圖2B為每組中加入SDF-1α分別0、1、10、20和50ng/mL后各組中HIF-1α的mRNA水平。

圖2 SDF-1α誘導的HIF-1α在卵巢癌細胞株SKOV3中的表達水平

Fig.2 Expression level of HIF-1α induced by SDF-1α. in ovarian cancer cell line SKOV3

圖3 各組細胞中HIF-1α的蛋白表達水平

Fig.3 Protein expression levels of HIF-1α in each cell group

2.4 p38絲裂原活化蛋白激酶在基質細胞衍生因子-1α/缺氧誘導因子-1α誘導的卵巢癌細胞遷移中的作用

進一步分析SDF-1α/HIF-1α誘導卵巢癌細胞遷移的作用機制，Western分析表明，SDF-1α誘導p38MAPK的活化，見圖4A。當用p38MAPK通路抑制劑SB203580處理后，細胞中SDF-1α誘導的HIF-1α的表達水平明顯受到抑制，見圖4B。

注：圖4A為各組細胞中pp38、p38的蛋白表達水平；圖4B為各組細胞中HIF-1α的蛋白表達水平。

圖4 pp38、p38及HIF-1α的蛋白表達水平

Fig.4 Protein expression levels of pp38, p38 and HIF-1α in each cell group

3 討論

3.1 趨化因子CXCR及其受體

趨化因子CXC受體(CXCR)是Gt類趨化因子，定位于第4號染色體，是完整的膜蛋白，可與CXC趨化因子家族成員特異性結合。目前已經發現哺乳動物有7種趨化因子受體，分別被命名為CXCRl～CXCR7。CXCRl和CXCR2密切相關，CXCRl的配基是人類CXCL8[也稱為白細胞介素(IL)-8]和CXCL6。CXCR2與CXCLl～CXCL7結合，CXCRl和CXCR2均表達在中性粒細胞表面，對中性粒細胞的趨化具有重要意義。CXCR3主要表達在T淋巴細胞和某些B淋巴細胞及自然殺傷細胞，細胞被激活后高表達，CXCR3有2種同種型：CXCR3-A和CXCR3-B，有3種高選擇性配基：CXCL9、CXCLl0和CXCLl 1(IFN 7、7 IP-10和Mig)，7 IP-10和Mig是CXC趨化因子超家族的2個成員，IFN 7可以極大程度地上調它們的表達。7 IP-10和Mig是CXCR3的功能性激動劑。這兩種蛋白對NK細胞和活化T細胞有很強的激活作用，還介導IFN 7和脂多糖的作用及介導T細胞依賴的抗腫瘤作用[2]，趨化因子擁有40～50種蛋白質的家族，CXCR與SDF-1α(基質細胞來源因子，又名CXCL12)均為GPCR家族成員[3]，廣泛分部在中性粒細胞、T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、朗格漢斯細胞以及樹突狀細胞等造血細胞上。趨化因子對腫瘤發展進程的調控主要通過與其受體結合完成的，趨化因子授予G蛋白偶聯的7次跨膜受體超家族。SDF-1α作為趨化因子家族成員之一，具有參與腫瘤細胞趨化性、血管生成及腫瘤轉移的功能，已成為近些年來的研究熱點。目前已有大量實驗研究表明SDF-1α在多種癌癥中均有表達，可通過與其相應的受體結合活化下游的信號通路，從而促進了癌癥的侵襲、轉移[4]。本研究前期實驗已證明SDF-1α通過與其受體CXCR4結合形成SDF-1α/CXCR4生物軸誘導的卵巢癌細胞的侵襲性與αvβ6的表達相關，αvβ6整合素通過活化p38 MAPK及PI3K/Akt信號通路誘導下游uPA的表達，進而促進卵巢癌細胞的侵襲性[5]。

3.2 缺氧誘導因子-1α及其與基質細胞衍生因子-1α之間的關系

HIF-1α被認為是缺氧狀態下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種關鍵的轉錄因子，它可激活相關目的基因的轉錄，從而促進腫瘤的發生和發展。HIF-1α是由826個氨基酸組成，N端具有一個堿性螺旋-環-螺旋結構域(bHLH)和一個PAS(Per-ARNT-Sim)結構域，這兩種結構域共同參與靶基因上的低氧反應元件結合，引起一系列反應，利于腫瘤在缺氧條件下的能量代謝和氧輸送，為腫瘤的生長和轉移提供基礎。已有研究證明HIF-1α在卵巢癌組織中表達，提示HIF-1α對卵巢上皮癌的發生、發展起重要作用[6]。Mi-Kyoung Kim等[7]已證實，HIF-1α表達量的增加是依賴其上游的p38 MAPK信號通路的活化。

本實驗設想SDF-1α是否可通過p38 MAPK-HIF-1α通路來調控卵巢癌細胞的遷移。結果顯示：HIF-1α在卵巢癌患者組織中的陽性表達率明顯增高，提示HIF-1α可能在卵巢癌的進程中起著重要作用；RT-PCR分析表明，SDF-1α刺激后可明顯誘導人卵巢癌細胞SKOV3中HIF-1α的mRNA水平，表明SDF-1α能夠促使卵巢癌細胞表達HIF-1α；Western分析表明，SDF-1α誘導p38 MAPK的活化，當用p38 MAPK通路抑制劑SB203580處理后，細胞中SDF-1α誘導的HIF-1α的表達水平明顯受到抑制，提示SDF-1α通過激活p38 MAPK信號通路促進其下游的HIF-1α表達，從而促進卵巢癌細胞轉移。本研究明確了SDF-1α通過p38 MAPK-HIF-1α通路促進卵巢癌細胞轉移的機制，從而更好地為卵巢癌的靶向治療提供新的思路，對臨床診療起重要指導意義。

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[2]薛剛,黃靜,張慧芹,等.三葉因子3和SDF-1/CXCR4生物軸在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及臨床意義[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2014,28(2):108-112.

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[5]XUE Bao-yao, WU Wei-guang, HUANG Kan,etal.Stromal cell-derived factor-1(SDF-1) enhances cells invasion by αvβ6 integrin-mediated signaling in ovarian cancer[J].Mol Cell Biochem,2013,380(1-2):177-184.

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[專業責任編輯：安瑞芳]

Stromal cell-derived factor-1 alpha(SDF-1α) enhances cells invasion by p38MAPK-HIF-1α mediated signaling in ovarian cancer

XUE Bao-yao, ZHAO Jing, ZHANG Xi-yuan, JIANG Xia, ZHOU Zhuo, YU Yue-cheng

(DepartmentofObstetricsandGynecology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

Objective To observe the role and mechanism of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) in ovarian cancer cell migration regulated by stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-1α). Methods The expression of HIF-1α in cervical cancer was analyzed by immunohistochemistry. HIF-1α siRNA was transfected into ovarian cancer cell line SKOV3, and then treated with SDF-1α and SDF-1α+SB203580, respectively. The expression levels of HIF-1α and p38MAPK were confirmed by RT-PCR and western blotting. Results Immunohistochemical analysis showed that the expression of HIF-1α in ovarian cancer tissues was overexpressed, and that at the same time SDF-1α could induce the expression of mRNA and protein levels in HIF-1α. After transfected by HIF-1α siRNA, the HIF-1α expression level decreased obviously. When treated by SB203580, the expression level of HIF-1α induced by SDF-1α decreased significantly. Conclusion SDF-1α can regulate cells invasion by p38MAPK-HIF-1α mediated signaling in ovarian cancer. Therefore, this study will provide a new research direction for prevention and treatment of ovarian cancer.

stromal cell-derived factor-1 alpha(SDF-1α)；MAPK pathway；hypoxia inducible factor-1α；ovarian cancer；cells invasion

2014-07-09

薛寶瑤(1988-)，女，主治醫師，碩士研究生，主要從事婦科腫瘤的研究。

于月成，副教授/副主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.025

R737.33

A

1673-5293(2015)02-0243-03