左歸丸和巴氯芬聯用對腦癱鼠運動認知的影響

李 玲，焦銀香，張 菡，李 靜，李紅霞

(1.陜西省康復醫院，陜西 西安710061；2.未央區張家堡社區健康服務中心，陜西 西安710021；3.西安交通大學藥學院，陜西 西安710061)

左歸丸和巴氯芬聯用對腦癱鼠運動認知的影響

李 玲1，焦銀香2，張 菡3，李 靜3，李紅霞1

(1.陜西省康復醫院，陜西 西安710061；2.未央區張家堡社區健康服務中心，陜西 西安710021；3.西安交通大學藥學院，陜西 西安710061)

目的 探討左歸丸和巴氯芬聯用對新生腦癱大鼠運動協調能力和認知能力的影響，并研究其可能的機制。方法 隨機將SD大鼠分為假手術組、腦癱(CP)模型未給藥組、CP模型左歸丸組、CP模型巴氯芬組以及CP模型左歸丸+巴氯芬聯用組。分別于藥物處理前，處理7、14、21、28天及治療結束后7天時分別測定各組大鼠神經行為學指標，治療結束后7天后測定血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)，一氧化氮合酶(NOS)和腦組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的變化。結果 巴氯芬治療組和聯用組在服藥14天后與同期CP模型未給藥組比較肌張力顯著降低(t值分別為4.603、5.590，均P<0.05)，通過平衡木時間縮短(t值分別為6.337、5.575，均P<0.05)；而左歸丸組于治療28天后，大鼠通過平衡木時間才顯著縮短(t=6.124，P<0.05)。左歸丸治療組和聯用組大鼠服藥28天后學習記憶能力較CP模型未給藥組明顯改善(t值分別為-4.314、-5.314，均P<0.05)；聯用組效果優于左歸丸組(t=-2346，P<0.05)；而巴氯芬處理組大鼠則無明顯變化(t=-2.025，P>0.05)。與CP模型未給藥組相比，左歸丸組以及聯用組大鼠的TNF-α、NOS和MDA顯著降低，SOD顯著升高，同時神經生長因子(NGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)mRNA和蛋白水平升高(左歸丸組：t值分別為2.456、4.898、5.803、-6.144，-4.224、-5.124、-3.272、-4.166；聯用組：t值分別為2.833、5.009、9.078、-6.056，-7.439、-7.142、-5.812、-4.301；均P<0.05)，聯用組的作用比左歸丸組更強(t值分別為2.613、3.241、2.624、-3.194、-3.275、-4.002、-3.986、-2.881，均P<0.05)，而巴氯芬組上述指標無明顯變化(P>0.05)。結論 左歸丸和巴氯芬聯用與單獨用藥相比能明顯改善大鼠運動，且有可能通過保護神經細胞，促進神經元的修復來改善其認知功能。

左歸丸；巴氯芬；聯用；小兒腦癱；動物模型

小兒腦性癱瘓(簡稱腦癱，cerebral palsy，CP)是指發生于受孕期至嬰兒期的一種非進行性腦損傷和發育缺陷所導致的綜合征，主要表現為姿勢異常與運動障礙，并發不同程度智力障礙、癲癇、感知和交流障礙以及其他異常。據報道，我國小兒腦癱的患病率約為1.8～6.0‰，因此腦癱是當今導致兒童殘疾的主要原因之一。腦癱的發病機制復雜，是多因素綜合作用的結果，高危因素中以早產、窒息、核黃疸為主[1]。

腦癱常用的治療方法主要是中西醫藥物、手術治療、中醫針灸按摩和康復訓練等多種手段相結合的綜合治療方法[2]。盡管腦癱的治療已取得很大的進步，但目前的治療僅限于對癥支持，缺乏特效治療。巴氯芬為氨基丁酸激動劑，可抑制異常的單突觸伸肌活動和多突觸的屈肌活動，降低肌張力，還可抑制興奮神經遞質的釋放，弱化疼痛感受，從而改善腦癱癥狀，但臨床上巴氯芬口服吸收效率差，而鞘內注射則會導致腦脊液漏和感染等并發癥發生率升高，且停藥后易反彈[3]。左歸丸方源自《景岳全書》，為真陰不足精髓內虧所致諸證而設，具有補腎益髓之功效。研究表明左歸丸可能通過調節氨基酸類神經遞質受體表達，改善神經內分泌穩態[4]。本文將應用單側頸總動脈結扎結合缺氧的方法建立新生腦癱大鼠動物模型，研究左歸丸、巴氯芬以及二者聯用對腦癱大鼠神經運動學行為以及學習記憶能力的影響，并進一步探討其作用機制。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗動物和藥品及試劑

7日齡新生清潔級SD大鼠(12～15g)，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。

巴氯芬，10mg/片。左歸丸(組成：熟地黃、菟絲子、牛膝、龜甲膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子)國藥準字：Z41020696，使用前用生理鹽水配制成相應濃度的溶液。腫瘤壞死因子(TNF-α)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)，ELISA試劑盒(南京建成生物研究所)；神經生長因子(NGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)抗體(美國Santa Cruz)。

1.2 腦癱大鼠模型建立

7日齡SD新生鼠注射三氟溴氯乙烷麻醉后取仰臥位固定在木板上，75%酒精消毒皮膚，行頸部正中切口，分離皮下脂肪，血管鉗分離出左頸總動脈，并用7號滅菌絲線雙線結扎并剪斷血管，術中用明膠海綿止血，縫合傷口并再次消毒皮膚，整個手術過程在10分鐘內完成。而后37℃水浴箱復溫，回籠休息2～4小時，放入37℃恒溫的密閉缺氧箱內，向缺氧箱內通含8%氧氣和92%氮氣的混合氣體(氣流量0.5L/min，溫度為37℃，濕度為70%±5%)，低氧處理2h后取出，繼續保溫1h。實驗結束后，放回鼠籠由母鼠行母乳喂養。

實驗動物分組及給藥：將實驗大鼠隨機分為5組，即假手術組、CP模型未給藥組、巴氯芬組、左歸丸組以及巴氯芬和左歸丸聯用組，每組動物10只。假手術組大鼠僅予以分離左頸總動脈，不予結扎和缺氧處理，其他組大鼠均行單側頸總動脈結扎手術并結合缺氧處理。假手術組和CP模型未給藥組：正常喂養，灌胃同體積生理鹽水；左歸丸組：左歸丸3g·kg-1·d-1灌胃；巴氯芬組：10mg·kg-1·d-1灌胃；左歸丸+巴氯芬組：左歸丸3g·kg-1·d-1+巴氯芬10mg·kg-1·d-1灌胃。造模成功后第1天起連續灌胃4周。

1.3 肌張力測定

各組大鼠分別于治療前、治療7、14、21和28天后對后肢肌張力進行測定。將電刺激針插入后肢股四頭肌內，一端連接于WQ9E痛閾測量儀。在大鼠后肢下端系一絲線，絲線經傳感器與LMS-2A 型生理記錄儀相連接，定時對股四頭肌進行刺激通過記錄儀記錄后肢伸直的幅度，并均以雙側后肢分別進行評定分級，每只大鼠的肌張力分級為雙側分級的均值。

1.4 平衡木行走試驗

分別于治療前、服藥7，14，21，28天分別應用平衡木行走實驗對大鼠運動整合及協調能力進行評價[5]。平衡木寬1.5cm，長100cm，平放在距離地面50cm高處，兩端分別連接長12.5cm方形平臺，其中一端放置25cm×25cm×20.5cm開口向平衡木的黑色箱子。大鼠向箱子處行走以逃避外界噪音干擾，用秒表記錄大鼠通過100cm平衡木所需的時間。

1.5 Y迷宮試驗

Y迷宮試驗參照徐秉炬的方法進行[6]。結果記錄20次反應中的正確反應次數。測試分別于治療前、服藥14、21和28天時以及停藥后7天進行。

1.6 逆轉錄-聚合酶鏈反應

末次給藥處理后第7天，每組任取5只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)進行麻醉，中性福爾馬林溶液心臟灌流犧牲動物，取腦組織勻漿低溫離心。采用RNA iso plus kit試劑盒提取組織總RNA，按照試劑盒要求操作。引物序列：NGF：5'-CTG GAC CCA AGC TCA CCT CA-3'(sense)，5'-GTG GAT GAG CGC TTG CTC G -3' (antisense)；BDNFL：5'-CTG ACC AGT TTG ATG ACG TC-3' (sense)，5'-TCT AAA AAC GAC AGG TCG TC-3'(antisense)；β-actin，5'-CTT AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3'(sense)，5'-CTG TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3' (antisense)。按實驗室常規方法進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增。反應條件為：94℃預變性10分鐘，94℃變性30秒，60℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，30個循環后，72℃延伸5分鐘。以β-actin為內參，計算各樣本NGF和BDNF的mRNA的相對表達量。

1.7 蛋白質印跡法

末次給藥處理后第7天，取各組大鼠腦組織加裂解液進行勻漿，離心后取上清，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，冰浴進行電泳，電泳后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉4℃封閉2小時后加5%脫脂奶粉稀釋好的一抗，室溫反應60分鐘；用TBST緩沖液洗膜10分鐘×3次；加入辣根過氧化物酶標記的NGF、BDNF二抗室溫孵育2小時。洗膜后ECL發光，X-光片顯影、定影、掃描儀掃描膠片。采用Image-ProPlus 6.0軟件對NGF和BDNF蛋白條帶進行定量分析，以β-actin作為內參。

1.8 酶聯免疫吸附反應

末次給藥處理后第7天，分別取各組大鼠血清和腦組織，利用酶聯免疫吸附反應(ELISA)法測定各組大鼠血清中TNF-α，NOS以及腦組織中MDA、SOD的含量，具體步驟按說明書進行。

1.9 統計學方法

以SPSS 12.0統計分析軟件進行統計，采用t檢驗分析，組間比較采用方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 左歸丸與巴氯芬聯用對腦癱大鼠肌張力及后肢運動功能的影響

為了評價左歸丸與巴氯芬聯用對腦癱大鼠運動能力的改善作用，本研究分別測定了治療前以及治療28天內不同時間點各組大鼠后肢肌張力等級與運動能力，結果顯示，與假手術組大鼠相比，CP模型未給藥組大鼠肌張力等級顯著升高(t=-26.67，P<0.05)。與治療前和同期CP模型未給藥組相比，左歸丸治療組大鼠在灌胃服藥28天之后肌張力明顯降低(t值分別為4.365和3.825，均P<0.05)。而巴氯芬治療組以及聯用組大鼠在藥物處理14天后肌張力均顯著下降(與治療前比，t值分別為4.563和3.986；與同期CP模型比，t值分別為4.603和5.590；均P<0.05),見表1。另外，在平衡木行走試驗中，CP模型未給藥組大鼠通過平衡木的時間顯著增加(t=-11.997，P<0.05)，而巴氯芬單用組以及聯用組可在14天后顯著縮短大鼠通過平衡木的時間(t值分別為6.337和5.575，P<0.05)，且聯用組效果優于巴氯芬單用組，而左歸丸組于治療28天后，大鼠通過平衡木時間顯著縮短(t=6.124，P<0.05)，見圖1。

表1 各組大鼠治療前和治療后肌張力評級

注：與治療前相比*P<0.05；與同期模型組比較#P<0.05。

圖1 各組大鼠不同時間點通過平衡木所用時間

Fig.1 The time used to get through the balance for rats of different groups at different time point

2.2 左歸丸與巴氯芬聯用對大鼠學習記憶能力的影響

分別于治療前、服藥28天內不同時間點以及停藥后7天測定各組大鼠Y迷宮試驗正確反應次數，結果顯示，模型未給藥組大鼠反應次數于同期假手術組相比顯著下降(t=9.375，P<0.05)。左歸丸治療組大鼠在服藥21天后，反應次數較治療前顯著升高(t=-3.652，P<0.05)；28天后顯著高于同期CP模型未給藥組(t=-4.314，P<0.05)；且停藥7天后，療效仍可維持。巴氯芬治療組大鼠則在治療前后反應次數無明顯變化(t=-2.025，P>0.05)，同時，巴氯芬與左歸丸聯用組大鼠也在治療21天后較治療前學習記憶能力顯著改善(t=-2.303，P<0.05)，并且改善效果略優左歸丸單用(t=-2346，P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠治療前和治療后Y迷宮正確反應次數變化

2.3 左歸丸與巴氯芬聯用對大鼠組織細胞因子和氧化應激水平的影響

利用ELISA法分別測定各組大鼠血清中TNF-α和NOS以及腦組織中SOD和MDA的水平變化。結果顯示，CP模型未給藥組大鼠血清中TNF-α、NOS以及腦組織MDA含量顯著高于假手術組，SOD含量顯著下降(t值分別為-4.628、-8.874、-8.227和9.005，均P<0.05)；與模型組相比，左歸丸單用組和左歸丸與巴氯芬聯用組可顯著降低TNF-α、NOS和MDA的水平，同時促進SOD含量增加(左歸丸單用組，t值分別為2.456、4.898、5.803和-6.144；聯用組，t值分別為2.833、5.009、9.078和-6.056；均P<0.05)；而巴氯芬治療組與CP模型未給藥組相比各因子水平無顯著性差異(t值分別為1.978、-0.082、-2.083和2.164，均P>0.05)；左歸丸與巴氯芬聯用效果優于單用左歸丸(t值分別為-2.613、-3.241、-2.624、-3.194，均P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠細胞因子和氧化應激水平的變化

注：與假手術組相比*P<0.05；與模型組比較#P<0.05。

2.4 左歸丸與巴氯芬聯用對大鼠腦組織神經生長因子和腦源性神經營養因子表達的影響

分別利用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白質印跡法(Western Blotting)檢測各組大鼠腦組織中NGF和BDNF分別在基因轉錄水平(mRNA水平)和蛋白表達水平的變化，結果顯示，CP模型未給藥組大鼠腦組織NGF和BDNF的mRNA和蛋白水平較假手術組均明顯降低(t值分別為10.071、10.216，6.942、7.746，均P<0.05)，左歸丸單用組及聯用組則顯著促進了腦癱大鼠NGF和BDNF的轉錄和表達(左歸丸組NGF和BDNF的基因轉錄水平：t值分別為-4.224、-5.124，NGF和BDNF的蛋白表達水平t值分別為-3.272、-4.166；聯用組NGF和BDNF的基因轉錄水平：t值分別為-7.439、-7.142，NGF和BDNF的蛋白表達水平：t值分別為-5.812、-4.301；均P<0.05)，而巴氯芬組則對腦癱大鼠腦組織中NGF和BDNF的轉錄和表達水平無明顯影響(NGF和BDNF的基因轉錄水平：t值分別為-2.014、-1.955，NGF和BDNF的蛋白表達水平：-1.749、-1.022；均P>0.05)；與左歸丸組單用組比，聯用組更能促進二者的表達，見圖2。

A：NGF和BDNF的mRNA水平；B：NGF和BDNF的表達水平

A: MRNA levels of NGF and BDNF; B: Expression levels of NGF and BDNF

1：假手術組；2：CP模型未給藥組；3：左歸丸治療組；4：巴氯芬治療組；5：左歸丸+巴氯芬治療組

1:Sham-operated group, 2: CP model without treatment group, 3:Zuoguiwan group, 4: Baclofen group, 5: Zuoguiwan combined with Baclofen group

注：與假手術組相比*P<0.05；與CP模型未給藥組比較#P<0.05。

圖2 各組大鼠腦組織中NGF和BDNF的mRNA和蛋白表達水平

Fig.2 MRNA and protein expression levels of NGF and BDNF in brain tissue of different rat groups

3 討論

3.1 藥物聯用對腦癱大鼠運動功能的改善

腦癱是幼兒殘疾病中最嚴重病因之一，由于環境污染、高齡產婦增多等原因，腦癱的發病率呈現上升趨勢。本文中，與假手術組大鼠相比，CP模型未給藥組大鼠肌張力等級顯著升高，通過平衡木的時間顯著增加，Y迷宮試驗正確反應次數顯著下降，提示建立的動物模型符合腦癱的基本特征，可用于后續研究。

在改善新生腦癱大鼠運動功能方面，左歸丸可以改善運動功能，但起效時間較晚；而巴氯芬和巴氯芬與左歸丸聯用顯效時間均較短，而且聯用治療效果較單用巴氯芬好，提示巴氯芬對于改善腦癱大鼠運動功能效果較好，左歸丸具有增強巴氯芬治療效果的作用。

3.2 藥物聯用可降低腦組織氧化應激水平

在CP的發病過程中，存在于腦組織中的細胞因子及其受體對中樞神經系統的多項生理功能均具有調控作用。NOS是專一催化NO生物合成的酶，所以體內NO的生物作用完全依賴于NOS。NO氧化產物的大量生成可引起強烈的神經毒性，進而引起神經細胞損傷。TNF-α是免疫-神經-內分泌網絡調節的主要分子之一，過度的TNF-α表現出明顯的神經細胞毒性。MDA水平的變化反映了腦組織自由基的水平和脂質過氧化的程度，同時也反映了神經細胞的受損程度[7]。本實驗結果表明左歸丸治療組和聯用組大鼠在治療21天后學習記憶能力顯著改善，同時兩組TNF-α、NOS和MDA的水平顯著降低，SOD含量增加，并且聯用組效果優于左歸丸組。因此，推測左歸丸通過抑制細胞因子NOS和TNF-α的生成，保護神經細胞，進而降低腦組織氧化應激性水平；且在藥物聯用的治療作用上，左歸丸發揮主要作用，巴氯芬具有增強療效的作用。

3.3 藥物聯用可促進神經元修復

NGF可誘導突觸生長，刺激胞體增大和促進樹突發育，促進蛋白合成，并促進受損的中樞神經纖維長出新的軸突，使其可直接到達原來的靶細胞處，建立新的突觸聯系。BDNF可以下調N-甲基-D-天冬氨酸受體功能，抵抗興奮性氨基酸的毒性，減輕自由基對神經元的損傷[8]。實驗結果顯示，左歸丸單用組以及聯用組顯著促進了腦癱大鼠NGF和BDNF的轉錄和表達，且聯用的效果更好，提示藥物通過促進腦組織中NGF和BDNF的合成和分泌，削弱神經元的損傷并促進神經元的修復，從而改善大鼠學習記憶能力。

本文通過建立CP大鼠模型探究左歸丸和巴氯芬對新生大鼠腦癱的治療作用，表明左歸丸具有神經保護作用，巴氯芬高效改善運動功能，左歸丸和巴氯芬聯用能改善大鼠運動功能，同時可能通過保護神經細胞，促進神經元的修復以改善其認知功能。因此，本研究將為腦癱患者的治療提供新的研究方向。

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[專業責任編輯：史曉薇]

Effect of combined application of Zuoguiwan and Baclofen on motor and cognition of rats with cerebral palsy

LI Ling1, JIAO Yin-xiang2, ZHANG Han3, LI Jing3, LI Hong-xia1

(1.ShaanxiRehabilitationHospital,ShaanxiXi’an710061,China;
2.WeiyangDistrictZhangjiabuCommunityHealthServiceCenter,ShaanxiXi’an710021,China;
3.PharmacyCollege,Xi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To investigate the effect of the combined application of Zuoguiwan and Baclofen on motor coordination ability and cognitive function of newborn rats with cerebral palsy (CP) and to study its possible mechanism. Methods SD rats were randomly divided into sham-operated group, CP model without treatment group, CP model with Zuoguiwan group, CP model with Baclofen group, and CP model with Zuoguiwan combined with Baclofen group. Neurobehavioral indexes were detected in each group before treatment, 7, 14, 21 and 28 day treatment, and 7 day after treatment, respectively. TNF-α and NOS in serum, and MDA and SOD in brain tissue of rats were measured in each group 7 day after treatment. Results Compared with CP model without treatment group, muscle tension reduced significantly and the time of going through the balance reduced in Baclofen group and Zuoguiwan combined with Baclofen group after having taken the drugs for 14 days (tvalue was 4.603, 5.590, 6.337 and 5.575, respectively, allP<0.05). While Zuoguiwan group shortened the time to go through the balance after 28 day treatment (t=6.124,P<0.05). Compared with CP model without treatment group, the contents of TNF-α, NOS and MDA declined significantly but the levels of SOD, NGF and mRNA rose remarkably (tZuoguiwan groupvalue was 2.456, 4.898, 5.803, -6.144, -4.224, -5.124, -3.272 and -4.166, respectively,tcombined groupvalue was 2.833, 5.009, 9.078, -6.056, -7.439, -7.142, -5.812 and -4.301, respectively, allP<0.05). The efficacy of the combined group was greater than Zuoguiwan group (tvalue was 2.613, 3.241, 2.624, -3.194, -3.275, -4.002, -3.986 and -2.881, respectively, allP<0.05). However, there was no obvious change in Baclofen group (P>0.05). Conclusion Compared with single drug therapy, combined application of Zuoguiwan and Baclofen can improve motor more obviously, and it may improve the cognition function of rats by protecting neurocyte and repairing neuron.

Zuoguiwan；Baclofen;combined application;infant cerebral palsy;rat model

2014-06-12

李 玲(1978-)，女，主治醫師，主要從事兒童康復方面的工作。

李紅霞，主任醫師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015. 02.015

R715.3

A

1673-5293(2015)02-0210-04