凍融卵裂期胚胎移植中過夜培養對臨床妊娠結局的影響

李 榮，許常龍，譚秀群，鄧志華，李春苑，丘 映

(南寧市第二人民醫院生殖醫療中心，廣西 南寧 530031)

凍融卵裂期胚胎移植中過夜培養對臨床妊娠結局的影響

李 榮，許常龍，譚秀群，鄧志華，李春苑，丘 映

(南寧市第二人民醫院生殖醫療中心，廣西 南寧 530031)

目的 探討凍融卵裂期胚胎移植中過夜培養對臨床妊娠結局的影響。方法 2011年12月至2012年12月在我院生殖醫療中心接受玻璃化冷凍的卵裂期胚胎移植患者共237個周期，其中胚胎解凍時間為移植當日128個周期(A組)，過夜培養109個周期(B組)，比較兩組的胚胎種植率、臨床妊娠率、流產率。結果 A組胚胎種植率低于B組(P< 0.05)，而臨床妊娠率和流產率與B組，差異無統計學意義(P> 0.05)。結論 將胚胎提前解凍培養過夜，觀察解凍后胚胎的進一步發育情況，可提高胚胎種植率，為臨床選擇移植胚胎提供有意義的參考。

凍融胚胎移植；玻璃化冷凍；過夜培養；胚胎種植率；臨床妊娠率

目前凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)已成為輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)技術中不可缺少的一部分。但是，胚胎細胞在程序冷凍法冷凍過程中容易形成冰晶，損傷細胞膜及細胞內結構，對細胞造成致命的傷害，而玻璃化冷凍可以很好地解決這一問題[1]。影響玻璃化凍融胚胎移植的因素很多，本研究通過提前解凍胚胎培養過夜，觀察胚胎進一步發育情況，探討胚胎過夜培養對FET妊娠結局的影響，為臨床提高FET妊娠率提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年12月至2012年12月在我中心接受凍融卵裂期胚胎移植的患者237個周期?；颊吣挲g20～47歲[(32.11±4.55)歲]；常規體外受精-胚胎移植(IVF)周期155例，卵胞漿內單精子注射(ICSI)周期82例。均符合以下標準：不孕因素為輸卵管阻塞和(或) 男性少弱精；均為首次 IVF 或 ICSI 治療未育且移植玻璃化冷凍第3天卵裂期胚胎的周期。排除：程序化冷凍胚胎移植周期、囊胚移植周期、解凍后繼續培養成囊胚再移植周期。其中移植當日解凍胚胎128個周期(A組)，過夜培養109個周期(B組)。A組年齡(32.22±4.77)歲，平均解凍胚胎數(2.33±0.59)個，B組年齡(32.11±4.55)歲，平均解凍胚胎數(2.20±0.50)個，兩組一般情況比較差異無統計學意義(P> 0.05)。

1.2 方法

1.2.1 超促排卵 兩組取卵周期超排卵方案均采用我中心常規長方案：在前次月經周期的第18～20天(黃體中期)使用促性腺激素釋放激素類似物(GnRHa，達菲林)降調節，注射劑量0.8～1.3 mg，14～16天后復診，在達到降調節標準后開始使用促性腺激素(Gn)，結合陰式超聲及血清黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕激素(P)水平測定，確定人絨毛膜促性腺激素(hCG)日。當主導卵泡中1個直徑達18 mm或2個達17 mm或3個達16 mm時，可于當天停用Gn，并在當日22點注射hCG 5000～10000 IU，35～37 h后行陰道B超指引下經陰道穿刺取卵術。取卵后根據患者丈夫精液情況采用IVF或ICSI，胚胎培養，取卵后3天移植胚胎，并將剩余的優質胚胎予以玻璃化冷凍、保存。FET建議至少于取卵術后三個月進行。

1.2.2 凍融胚胎移植內膜準備 ①自然排卵周期：適用于月經規律，無排卵障礙者，于月經第10～12天開始經陰道超聲監測到優勢卵泡發育至15 mm時，于血清LH峰后3天或排卵后2天行冷凍胚胎移植。②激素替代周期：應用于月經周期紊亂及多囊卵巢綜合征及子宮內膜異位癥或其它原因導致排卵障礙者：月經第3～5天口服戊酸雌二醇，根據患者內膜情況，選擇不同起始劑量(4～8 mg/d)，服用5～7天后予以B超，以觀察其子宮內膜厚度。超聲監測須至子宮內膜厚度≥8 mm，測定E2水平，當E2> 200 pmol/L時肌內注射黃體酮60 mg/d，同時繼續口服戊酸雌二醇。用黃體酮第4天行冷凍胚胎移植。胚胎移植后根據不同子宮內膜準備方案及患者個體情況應用不同劑型劑量的孕酮進行黃體支持。

1.2.3 胚胎冷凍與解凍 ①試劑與耗材的準備：玻璃化冷凍試劑盒(Vitrification Kit)；玻璃化解凍試劑盒(Thawing Kit)；玻璃化冷凍載體(JY straw)；剝卵針(Denuding Pipettes)D160和D190。加拿大捷鷹公司(JIEYING Laboratory Inc.)；冷凍皿：Falcon3001；⑥解凍皿：Embryo GPS-010；⑦胚胎培養液：Votrolife 10131。②冷凍操作過程：制備冷凍皿，室溫下平衡20min后，將選擇用于凍存的胚胎1—2枚胚胎置于冷凍液JY-Vl中5 min，再轉入冷凍液JY-V2中1min立即將胚胎置于載體上，套上外套管，迅速將載體完全浸入液氮中，靜置10秒左右即可液氮罐貯存。③復蘇操作過程：制備解凍皿，室溫下平衡20min后，將凍胚載體從液氮取出，迅速置于解凍液JY-T1中3 min，再轉入稀釋液JY-T2中3 min，后轉入稀釋液JY-T3中3 min，后轉入沖洗液JY-T4中3 min，胚胎移入JY-T4后立即將恒溫板溫度升至37 ℃，最后轉移至胚胎培養液中，37 ℃ 6%CO2培養箱內培養。

1.3 胚胎解凍時間 ①A組：移植當日上午解凍胚胎，選擇復活卵裂球≥50%的胚胎進行移植。將解凍后存活的1～3個胚胎培養2 h后移植。②B組：移植前一天下午解凍胚胎，觀察胚胎如有50%以上卵裂球受損，則解凍其他保存的胚胎，培養過夜。移植時應觀察復蘇后胚胎生長情況，<50% 卵裂球受損，或至少有一個卵裂球發生卵裂，方可用于移植。

1.4 胚胎解凍后觀察指標及妊娠確定 優質胚胎評價標準為獲卵后第1 日(Day1)觀察正常受精、第3日(Day3)評分為Ⅰ、Ⅱ級，卵裂球6～12個的胚胎。以解凍后胚胎存活的卵裂球數≥50%總細胞數作為胚胎復蘇存活的標準。凍融胚胎移植后14天測血HCG判斷是否生化妊娠，在移植后4～5周經B超確定臨床妊娠。

1.5 統計學方法 應用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理。計量資料采用t檢驗，計數資料采用四格表χ2檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

237個凍融胚胎周期，解凍胚胎538枚，共移植凍融胚胎509枚，平均每周期移植(2.15±0.53)枚胚胎，其中124枚胚胎著床(凍融胚胎種植率為24.36%)，98例臨床妊娠(臨床妊娠率為41.35%)，13例流產(流產率為13.27%)，4例宮外孕(宮外孕發生率為1.68%)，81例分娩。A組胚胎種植率低于B組，而臨床妊娠率和流產率與B組比較差異無統計學意義，見表1。

表1 兩組胚胎種植率、臨床妊娠率、流產率比較 [%(n)]

3 討論

胚胎質量和胚胎與子宮內膜間是否能夠相互適應是胚胎著床成功與否的關鍵之處[2]。相關研究表明，早期卵裂胚胎來自胞漿和核同步性較好，并且較為成熟的卵子，具有較好的代謝儲備性能，其IVF-ET成功率也較高。但是，冷凍和復蘇可導致卵裂球部分或全部裂解甚至凋亡，從而影響胚胎發育潛能。ALIKANI研究發現顯微操作損傷鼠胚中的部分卵裂球后，囊胚孵出率顯著降低[3]。因此，去除壞死的卵裂球，則可有效提高凍融移植周期的臨床妊娠率[4]。目前，移植胚胎的選擇標準多是根據解凍后2～3 h 的胚胎形態來決定，但隨著商品化序貫培養試劑、培養條件及培育技術的不斷完善與改進，根據凍融胚胎的繼續發育狀況與潛能將成為以后移植胚胎選擇的新標準。陸湘等[5]發現，通過過夜培養，可使復蘇后部分破損卵裂球繼續生長、卵裂，恢復正常種植潛能。龔紹瓊等[6，7]認為提前解凍培養、選擇進一步卵裂的胚胎進行移植，有助于提高FET周期臨床妊娠率，改善妊娠結局。但羅金等[8]則發現提前一天解凍和當天解凍，對臨床妊娠率的影響差異無統計學意義。

本研究根據胚胎解凍時間分為移植當日解凍組和過夜培養組，結果顯示過夜培養組胚胎種植率高于移植當日解凍組，差異有統計學意義(P< 0.05)。兩組臨床妊娠率、流產率差異無統計學意義(P> 0.05)。與柴三明等[7]研究結果相似。提示在臨床中，可通過提前解凍胚胎過夜培養，觀察胚胎復蘇后進一步發育情況，評估其發育潛能，選擇優質的胚胎進行移植。

[1] 耿潔，胡玉琴，劉蘭蘭.卵子玻璃化冷凍在體外受精-胚胎移植取精失敗周期中的應用[J].實用醫院臨床雜志，2014，11(1)：156-157.

[2] 王靜，李豫峰，凍融胚胎移植結局的影響因素研究進展[J].中國優生與遺傳雜志，2009，17(2)：6-8，110.

[3] Alikani M，Olivennes F，Cohen J.Microsurgieal correction of partially degenerate mouse embryos promotes hatching and restores their viability[J].Hum Reprod，1993，8(10)：1723-1728.

[4] Rienzi L，Ubaldi F，Iacobelli M，et al.Developmental potential of fully intact and partially damaged cryopreserved embryos after laser-assisted removal of necrotic blastomeres and post-thaw culture selection[J].Fertil Steril，2005，84(4)：888-894.

[5] 陸湘，李路，高曉紅，等.卵裂球的完整性和生長與否對凍融胚胎移植妊娠結局的影響[J].生殖與避孕，2007，27(8)：518-521.

[6] 龔紹瓊.移植復蘇后進一步卵裂胚胎可提高凍融胚胎移植臨床妊娠率[J].現代醫院，2012，12(7).11-13.

[7] 柴三明，王琰，倪亞莉.過夜培養對凍融胚胎移植周期妊娠結局的影響[J].生殖與避孕，2010，30(7).490-493.

[8] 羅金，楊菁，徐望明.胚胎凍融后體外培養時間對妊娠結局的影響[J].生殖與避孕，2011，31(2)：97-100.

Impact of culture overnight during frozen-thawed cleavage-stage embryo transfers on pregnancy outcome

LI Rong，XUE Chang-long，TAN Xiu-qun，DENG Zhi-hua，LI Chun-yuan，QIU Ying

(Reproductive Medical Center，Nanning Second People’s Hospital，Nanning 530031，China)

QIUYing

Objective To explore the impact of culture overnight during frozen-thawed cleavage-stage embryo transfers on pregnancy outcome.Methods Data of 237 cycles of vitrified cleavage-stage embryos from the Third Affiliated Hospital between December 2011 and December 2012 was retrospectively analyzed.The embryo were divided into group A (embryo was thawed on the day of transplantation) and group B (embryo was culture overnight).The embryo implantation rate，clinical pregnancy rate and abortion rate were compared between the two groups.Results The embryo implantation rate was significantly lower in the group A when compared with that in the group B (P< 0.05).However，no significant difference in clinical pregnancy rate and abortion rate was found between the two groups.Conclusion It may provide a valuable reference for the selection of high quality of embryo when embryos are thawed in advance and cultured overnight，and then the development of embryos can be observed.This method also facilitates the arrangement of laboratory working.

Frozen embryo transplantation；Vitrification；Culture overnight；Embryo implantation rate；Clinical pregnancy rate

廣西醫科大學青年科學基金資助項目(編號：GXMUYSF201307)

丘 映

R714；S821.3+6

A

1672-6170(2015)04-0055-03

2014-12-23；

2015-03-24)