大鼠下頜前導后髁突軟骨組織中BMP-2的含量變化研究

張 勤， 鄭司鵬， 劉 紅， 刁曉潔， 賈 瑩

(1新疆醫科大學附屬中醫醫院口腔科， 烏魯木齊 830000； 2貴州醫科大學附屬口腔醫學院口腔正畸教研室， 貴州 貴陽 550002)

大鼠下頜前導后髁突軟骨組織中BMP-2的含量變化研究

張 勤1， 鄭司鵬1， 劉 紅1， 刁曉潔1， 賈 瑩2

(1新疆醫科大學附屬中醫醫院口腔科， 烏魯木齊 830000；2貴州醫科大學附屬口腔醫學院口腔正畸教研室， 貴州 貴陽 550002)

目的 探討下頜前導對大鼠髁突軟骨細胞骨形成蛋白-2(BMP-2)含量的影響。方法 64只雄性SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組大鼠全天佩戴自制的前導裝置，對照組不佩戴矯治器。于第0、1、3、5天及第1、2、4、8周分別處死各組大鼠，應用酶聯免疫吸附法(ELISA)定量檢測、分析大鼠髁突軟骨內BMP-2的含量變化。結果 (1)與對照組比較，實驗組大鼠髁突軟骨BMP-2含量增高，差異有統計學意義(P=0.000)。隨加力時間進展，BMP-2含量也隨之改變，各時間點BMP-2含量比較差異有統計學意義(P=0.011)。(2)下頜前導加載后髁突軟骨細胞BMP-2含量與時間呈二次項(拋物線)模型趨勢，體現一定的時間節律(P=0.000)。結論 下頜前導能夠促進髁突軟骨細胞BMP-2的釋放含量，從而可能參與髁突軟骨的骨改建過程。

下頜前導； 大鼠髁狀突軟骨細胞； 骨形成蛋白-2

目前，對骨性安氏Ⅱ類錯頜畸形的臨床矯治，其理想目標是期望實現骨改良，誘導下頜骨向前、上生長及位移。然而，下頜前導矯治裝置究竟能否切實產生骨效應，對其作用機制，業界尚存在廣泛爭議。骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)具有誘導骨與軟骨形成及保持軟骨表型等功能，是參與軟骨和骨發育的重要的細胞因子[1]，在骨組織修復工程中應用廣泛。因此，本研究擬通過觀察功能性下頜前導裝置對大鼠髁突軟骨BMP-2含量的影響，初步探討下頜前導矯治可能的骨性效應及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組健康雄性SD大鼠64只，35天齡(貴州醫科大學動物實驗中心提供)。根據是否安放前導咬合裝置，將所有動物隨機分為實驗組(安放前導裝置)和對照組(不安放前導裝置)，自口內咬合板放置完成記為第0天，并設立觀察時間點第0、1、3、5天及第1、2、4、8周。各時間點分別麻醉后處死各組大鼠，取雙側髁突組織，保存待用。

1.2 主要器材、試劑下頜前導矯治裝置(參照Rabie等[2]方法)(圖1)，登泰克通用光固化樹脂(登泰克牙科樹脂有限公司),大鼠BMP-2 ELISA檢測試劑盒(BMP-2 ELISA Kit,96T，Promage)，DMEM培養基(Hyclone,USA)。

圖1 大鼠下頜前導裝置

1.3 安放前導咬合裝置實驗組大鼠用0.3%戊巴比妥鈉1 mL/100 g腹腔注射麻醉，起效后，按照樹脂粘接步驟分別對大鼠上頜中切牙進行牙面酸蝕、干燥等處理，粘接預制好的前導咬合板。口內檢查并拖曳大鼠下頜向前至切牙對刃位置，修形、加固樹脂以確保阻擋下頜后退。對照組不作處理。所有動物同條件飼養。

1.4 軟骨細胞的分離及細胞凍融動物麻醉處死后，取下雙側髁狀突，將其軟骨層剝離，按矢狀向切取前、中、后軟骨組織。無菌條件下剪碎組織塊，移入無鈣平衡鹽液(D-Hank’s液)中，10倍量0.25%胰蛋白酶37℃振蕩消化30 min；0.2%Ⅱ型膠原酶1 mL，混勻，37℃振蕩消化2 h；15%小牛血清的DMEM培養基終止消化，1 000 r/min離心8 min；去上清液，加入含20%小牛血清的DMEM培養基混勻，轉移至25 mL培養瓶中，37℃、5% CO2孵箱內繼續培養。細胞貼壁后每隔2 天換液。透明軟骨細胞長成單層后，胰蛋白酶消化、收集細胞。按5×106個/孔接種密度制備細胞懸液并移入1 mL EP管中，-20℃反復凍融3次。取細胞凍融液，待測。

1.5 BMP-2含量測定酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法定量測定大鼠髁突軟骨細胞凍融液BMP-2含量，檢測步驟嚴格按試劑盒使用說明書操作。

2 結果

2.1 下頜前導力學加載引起大鼠髁突軟骨BMP-2含量變化與對照組比較，實驗組大鼠髁突軟骨BMP-2含量增高，差異有統計學意義(P=0.000)。隨加力時間進展，BMP-2含量也隨之改變，各時間點BMP-2含量比較，差異有統計學意義(P=0.011)，見表1、圖2。

2.2 大鼠髁突軟骨BMP-2含量與加力時間的關系大鼠髁突軟骨BMP-2含量與加力時間呈二次項(拋物線)模型趨勢(Quadratic,P=0.000)(圖3)。

2.3 髁突軟骨矢狀向分割區域BMP-2含量兩組髁突軟骨矢狀向前、中、后區域BMP-2含量比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

圖2 髁突軟骨細胞力學加載-BMP-2含量分布

圖3 髁突軟骨細胞BMP-2含量-時間曲線

表1 髁突軟骨細胞BMP-2含量測定結果(±s， ng/mL)

3 討論

臨床上骨性安氏Ⅱ類錯頜畸形、下頜骨功能性前伸后、下頜骨髁突的改建是整個矯治成功的關鍵。矯治II類錯頜最佳時機是患者恰好處于生長發育高峰期，本實驗選擇第35天齡的SD大鼠作為研究對象，且SD大鼠的顳下頜關節與人類相似，髁突軟骨發育規律也呈周期性變化，可以代表臨床上處于快速生長發育期的青少年。本實驗的大鼠前導實驗動物模型是常用的研究模型，整個實驗過程中，僅出現2例樹脂咬合板部分松脫、損壞的情況(可能是粘接安放過程中唾液隔濕不好所致)，有效地保證了實驗條件的均一性，確保了觀察髁突軟骨組織改建及變化的可靠性。劉瑩等[3]的研究也證實了這個結果。

本研究在實驗方法上也進行了科學地設計，對髁突軟骨原代細胞分離、培養擴增后即收獲并制取細胞凍融液進行ELISA檢測，避免了細胞傳代培養可能引起的細胞狀態及生物學信息的丟失或改變，竭力保留了實驗干預措施(下頜前導)對髁突軟骨細胞生物學行為影響的原始狀態，確保BMP-2檢測結果的客觀性和科學性[4]， 此與以往類似的研究[1]比較具有一定的先進性。

髁狀突是下頜骨的重要的生長發育區，下頜前導裝置引起髁突位置改變后，相應的機械刺激能夠引起髁突及顳頜關節發生一系列生物學改建。骨骼的改建需要各種生長因子的共同調控，使骨組織的吸收和形成維持著一種新的動態平衡。BMP-2是轉化生長因子-β超家族成員中最主要的骨形成調控因子，能通過提高和堿性磷酸酶的活性和增加骨鈣素及膠原蛋白的表達、合成及礦化小節的形成來刺激成骨細胞的分化 。BMP-2 還能引起多種細胞的增殖、分化和凋亡， 參與組織的再生和修復，尤其是骨和軟骨的修復及成骨細胞和破骨細胞的分化[1]。因此，本研究希望通過觀察下頜前導裝置戴入后髁突軟骨BMP-2表達的時間變化規律，進一步研究BMP-2在髁突軟骨改建中的可能機制及作用。

本實驗結果表明下頜前導力學加載能夠影響髁突軟骨細胞凍融液BMP-2濃度的變化，高于對照組水平，差異有統計學意義。提示下頜前導負荷能夠促進髁突軟骨釋放BMP-2，從而參與髁突軟骨的成骨改建[5]。此結果與相關的研究結果一致[6-7]。推測BMP-2可能參與了下頜前伸過程中的髁突改建。

本實驗從矢狀方向對髁突軟骨區域進行了分割，試圖進一步探究下頜前伸時軟骨改建的區域分布特征。然而實驗結果并不能反映BMP-2含量存在矢狀向區域分布差異，結果表明無論是對照組還是實驗組，同時間點髁突前、中、后區域BMP-2含量較均勻，差異無統計學意義(P>0.05),提示矢狀區域分布，髁突軟骨BMP-2含量較均勻。

趙志河等[8]建立的下頜骨三維有限元模型揭示下頜前伸時髁突后上部是張應力區，前部是壓應力區，有利于髁突向前下方向位移。結合本研究結果，推測BMP-2是在顳頜關節區負荷改變時參與一系列改建活動的其中一種細胞因子，尚不具有位置特異性標志特征，亦無法敏感地反映負荷的性質。另一種可能是本研究劃分髁突區域的方法不夠精確，無法完全代表髁突負載的真實情況，還需要在以后的研究中反復地實踐證實。

本研究顯示髁突軟骨受下頜前導力學負載后，BMP-2含量變化與時間變量呈拋物線模型趨勢，即在加力后第5～7 天時出現峰值含量，以后逐漸回落，接近初始水平；而對照組BMP-2未出現明顯的峰值,此結果反映了大鼠髁突軟骨釋放BMP-2具有一定的時間節律。顳頜關節力學負載能夠引起BMP-2的快速參與和反應；而后期回落則可能是髁突對力學加載適應性改建的結果。BMP-2參與髁突改建的機制還有待后續的研究證實。

[1]DeLucaF,BarnesKM,UyedaJA,etal.Regulationofgrowthplatechondrogenesisbybonemorphogeneticprotein-2[J].Endocrinology,2001,142(1):430-436.

[2]RabieAB,WongL,TsaiM.Replicatingmesenchymalcellsinthecondyleandtheglenoidfossaduringmandibularforwardpositioning[J].AmJOrthodDentofacialOrthop,2003 123(1):49-57.

[3] 劉瑩，湯歡，劉艷艷，等. 不同下頜前伸力對髁突Runx2 和X型膠原表達的影響[J]. 實用口腔醫學雜志, 2013, 29(5)：621-625.

[4] 金波濤,于紹冰,鄭衛衛,等.失重對大鼠髁突軟骨細胞中TNF-αmRNA表達的影響[J].實用醫藥雜志,2014, 31(1):47-48.

[5]ValteauB,GrimardG,LondonoI,etal.Invivodynamicbonegrowthmodulationislessdetrimentalbutaseffectiveasstaticgrowthmodulation[J].Bone,2011,49(5):996-1004.

[6] 李曉峰,王美青,儲嵐嵐,等.咬合紊亂與去除咬合紊亂對大鼠髁突軟骨中骨形成蛋白-2表達的影響[J].華西口腔醫學雜志, 2008,26(1):105-108.

[7] 盧紅飛,麥志輝,艾虹,等.機械牽張力作用下小鼠成骨細胞骨形成蛋白-2的濃度變化[J].中華口腔醫學研究雜志,2011,5(5):488-493.

[8] 趙志河,周學東,趙美英.下頜前伸時髁突的三維有限元分析[J].中華口腔醫學雜志,1999,34(2):85-87.

(本文編輯 楊晨晨)

The content of the BMP-2 in the cartilage of rat condyle after mandibular advancement

ZHANG Qin1, ZHENG Sipeng1, LIU Hong1, DIAO Xiaojie1, JIA Ying2

(1TheAffiliatedTraditionalChineseHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2AffiliatedStomatologySchool,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To observe the changes of Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) in the cartilage of rat condyle after mandibular constantly advancement and its impact on the condylar cartilage. Methods A total of 64 male rats were randomly divided into experimental and control groups. In the experimental group, each rat were worn on the bite-jumping appliances in order to advance the mandible for 24 hours. The rats were executed in each group after 0 d, 1 d, 3 d, 5 d, 1 w, 2 w, 4 w and 8 w. BMP-2 content was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results (1) The BMP-2 content was increased in the condylar cartilage. Compared with the control group, the difference was statistically significant (P=0.000).Alongwiththestrengthtimeprogress,BMP-2contentalsochanged,theBMP-2contentofeachtimepointwasdifferentsignificantly(P=0.011). (2)Afterwearingofbite-jumpingappliances,BMP-2contentinthemandibularcondylarchondrocytesandtimepresentaquadratictrend(parabolic)model,andreflectacertainamountoftimerhythm(P=0.000). Conclusion The bite-jumping appliance can promote the release of the condylar chondrocytes BMP-2 levels, which could participate in the process of condylar cartilage bone reconstruction.

bite-jumping; cartilage cells of rat; BMP-2

新疆醫科大學科研創新基金(ZYY201208)

張 勤(1965-)，女，本科，主任醫師，碩士生導師，研究方向：口腔正畸學。

賈 瑩，女，碩士，副教授，研究方向：口腔正畸學,E-mail：1746870529@qq.com。

R

A

1009-5551(2015)12-1489-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.008

2015-07-14]