TGF-β1促進食管癌上皮間質轉化的發生發展

王 棟， 劉 清， 鄭樹濤， 劉 濤， 戴 芳， 楊晨晨， 盧曉梅， 買買提艾力·吾馬爾

(1新疆醫科大學, 烏魯木齊 830011， 2新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院；3新疆維吾爾自治區食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

TGF-β1促進食管癌上皮間質轉化的發生發展

王 棟1,2， 劉 清2， 鄭樹濤2， 劉 濤2， 戴 芳2， 楊晨晨1， 盧曉梅3， 買買提艾力·吾馬爾1

(1新疆醫科大學, 烏魯木齊 830011，2新疆醫科大學第一附屬醫院臨床醫學研究院；3新疆維吾爾自治區食管癌研究所， 烏魯木齊 830054)

目的 探討轉化生長因子(TGF-β1)在促進食管癌Eca109細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化中的作用。方法 利用TGF-β1受體抑制劑和病毒轉染TGF-β1 干擾RNA(siRNA)處理Eca109細胞，分為3組：實驗組(病毒穩定TGF-β1 siRNA轉染Eca109細胞)、陰性對照組(轉染無關序列Eca109細胞)、空白對照組(正常未經任何處理的Eca109細胞)，采用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測TGF-β1及上皮間質轉化(EMT)相關指標E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、鋅指轉錄因子(Snail)]在mRNA水平表達情況；EMT相關指標蛋白(E-cadherin、Vimentin)的表達；細胞增殖實驗(MTT)、細胞劃痕實驗及Transwell法分別檢測細胞增殖、遷移、侵襲的變化情況。結果 通過TGF-β1受體抑制劑(0、0.1、1、10 μm/mL)處理Eca109細胞后，在mRNA水平TGF-β1表達逐漸降低， E-cadherin表達逐漸升高，Vimentin、Snail表達逐漸降低(P<0.05)；在蛋白水平，E-cadherin表達逐漸升高，Vimentin表達逐漸降低，細胞增殖和遷移能力也逐漸降低(P<0.05)。實驗組與空白對照組和陰性對照組相比，在mRNA水平實驗組TGF-β1表達降低(P<0.05)；在蛋白水平，實驗組E-cadherin表達增高，Vimentin表達降低；實驗組細胞增殖、遷移和侵襲能力均降低(P<0.05)。結論 在細胞水平，TGF-β1可促進食管癌細胞的增殖和上皮間質轉化的進程。

轉化生長因子(TGF-β1)；食管鱗癌；RNA干擾(RNAi)； 細胞增殖；上皮間質轉化(EMT)

食管癌是我國最高發的惡性腫瘤之一，世界范圍內食管鱗癌占所有食管癌的90%[1]。食管癌發病呈明顯的地區差異，新疆是其高發區[2]。食管癌病程進展快，早期不易被發現，但較早發生鄰近組織和遠端組織的轉移，以及對周圍組織的侵襲，大部分病人就診時病變已處于中晚期，造成其生存率普遍很低，其中75%的病人生存期少于1 a，癌的浸潤轉移是病人死亡的主要原因。上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞通過特定程序喪失上皮表型而轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移有著密切的關系[3-4]。轉化生子因子(TGF-β1)是調節腫瘤EMT的關鍵因子。本研究在細胞水平通過mRNA、蛋白、細胞功能學等實驗探討TGF-β1在促進食管癌Eca109細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)，DMSO(美國Invitrogen公司)，慢病毒TGF-β1及陰性對照病毒(上海吉凱公司)，食管鱗癌細胞系Eca109(武漢大學細胞庫)。TRizol試劑(invitrogen)， 反轉錄試劑盒(thermo)，SYBRⅡ熒光試劑盒(Takara)，BCA蛋定量白試劑盒，Vimentin抗體(Santa Cruz)，E-cadherin抗體及GAPDH抗體(Santa Cruz)，transwell小室(Corning Costar, 8 μm)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 食管鱗癌細胞系Eca109用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液正常培養，用0.25%胰蛋白酶消化液消化處于對數生長期的細胞。細胞均在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育。

1.2.2 TGF-β1抑制劑處理Eca109細胞 將正常Eca109細胞消化收集細胞沉淀，用含有1%胎牛血清的RPMI-1640培養液重懸，6孔板每孔接種細胞3×105個細胞，分為4組，每組做3個復孔，分別用TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μmol/mL處理Eca109細胞48 h，用含有1%胎牛血清的RPMI-1640培養液在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育。

1.2.3 TGF-β siRNA病毒轉染Eca109細胞 將正常Eca109細胞消化收集細胞沉淀，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養液重懸，分為3組：空白對照組(正常未經過任何處理的Eca109細胞)、陰性對照組(轉染隨機序列)和實驗組(轉染TFG-β1 siRNA)，每組設3個復孔。轉染48 h后細胞消化收集做流式分選，將分選收集的細胞重新種板培養。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶聯反應(qRT-PCR) 將收集的Eca109細胞同TRizol試劑處理提取總RNA，用反轉錄試劑盒中的Random Primer和Oligdt primer分別反轉錄總RNA為cDNA，SYBRⅡ熒光試劑盒對反轉錄的cDNA做RT-PCR，反應條件：初始變性，95℃反應10 min；變性，95℃反應15 s；退火，55℃(β-actin)、57℃(Vimentin)、59℃(TGF-β)、62℃(E-cadherin、Snail)反應30 s；延伸，72℃反應30 s，3個步驟共進行40個循環。β-actin作為mRNA的內參，結果用log10(2-ΔΔCt)法進行相對定量比較，每組實驗重復3次,反轉錄及qRT-PCR所用引物序列見表1。

表1 反轉錄及qRT-PCR所用引物序列表

1.2.5 Western blot測定EMT相關蛋白的表達 測定蛋白濃度(BCA蛋定量白試劑盒)并調整蛋白上樣量為50 μg/孔。電泳，轉膜，封閉1 h，加入Vimentin抗體、E-cadherin抗體及GAPDH抗體。4℃搖床孵育過夜。加入二抗孵育2 h，化學試劑發光法(ECL)顯色。

1.2.6 MTT細胞增殖實驗 每孔接種3×103個對數生長期的Eca109細胞于96孔板中，每孔200 μL細胞懸液，每組設4個復孔，分別于孵育0、24、48、72、96 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育4 h，棄去上清液，加入150 μL的DMSO(二甲基亞砜)，充分震蕩混勻后，用酶標儀測490 nm處吸光度值。

1.2.7 細胞劃痕實驗 6孔板每孔接種5×105個細胞，過夜鋪滿6孔板，用10 μL無菌槍頭在每孔底部輕劃1條粗細均勻、力度和角度一致的直線。分別于0、24、48、72 h在倒置顯微鏡下的同一視野觀察劃痕寬度并拍照。

1.2.8 細胞侵襲實驗 取24孔板，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，每組細胞按3×105個用無血清RPMI1640培養基混勻接種于transwell小室上室，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱孵育48 h后，用棉簽擦去上室內未遷移的細胞，4%多聚甲醛固定2 min，甲醇固定30 min，結晶紫染色30 min，PBS清洗，在200倍視野下觀察，每一樣本隨機選取5個視野，計數每個視野下染色細胞數量，取平均值。

2 結果

2.1 用TGF-β1受體抑制劑抑制Eca109細胞后TGF-β1及EMT相關指標mRNA的表達隨著TGF-β1受體抑制劑濃度的提高，TGF-β1表達量逐漸降低， EMT相關指標E-cadherin表達量逐漸升高，Vimentin、snail表達量逐漸降低，各組比較差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

2.2 用TGF-β1受體抑制劑抑制Eca109細胞后EMT相關指標蛋白的表達分別用TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μm/mL處理Eca109細胞48 h后，用Western blot檢測各組細胞Vimentin、E-cadherin、GAPDH蛋白的表達。抑制TGF-β1受體后能夠降低間質標志物Vimentin的表達，增加上皮標志物E-cadherin的表達，從而延緩EMT的進程(圖2)。

2.3 MTT檢測TGF-β1受體抑制劑抑制Eca109細胞后細胞增殖能力變化隨著TGF-β1抑制劑的濃度提高，Eca109細胞增殖能力減緩，與0 h相比，差異有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

與TGF-β1受體抑制劑0μm/mL比較，*P<0.05。

圖1 用TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μm/mL處理Eca109細胞TGF-β、E-caherin、Vimentin、Snail的mRNA相對表達量

圖2 Western blot檢測TGF-β1受體抑制劑梯度抑制Eca109細胞后EMT相關蛋白的表達

圖3 TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μm/mL處理Eca109細胞的細胞增殖曲線

2.4 細胞劃痕檢測TGF-β1受體抑制劑抑制Eca109細胞后細胞遷移能力變化隨著TGF-β1受體抑制劑濃度的提高，細胞遷移速度顯著減慢，72 h后陰性對照組細胞劃痕寬度明顯減小(P<0.05) (圖4)。

2.5 熒光檢測Eca109細胞轉染TGF-β1 siRNA效果熒光倒置顯微鏡下觀察見綠色熒光在細胞內廣泛表達，TGF-β1 siRNA轉染效果良好(圖5)。

2.6 穩定轉染TGF-β1 siRNA后Eca109細胞中TGF-β1的mRNA表達實驗TGF-β1 mRNA表達量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。而陰性對照組和空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖6)。

圖4 TGF-β1受體抑制劑0、0.1、1、10 μm/mL處理Eca109細胞的細胞遷移能力比較(×100)

圖5 TGF-β1 siRNA轉染Eca109細胞

圖6 穩定轉染后Eca109細胞TGF-β1 mRNA相對表達量

2.7 穩定轉染TGF-β1 siRNA后Eca109細胞中EMT相關蛋白的表達實驗組E-cadherin蛋白表達量明顯高于陰性對照組和空白對照組，而Vimentin表達量明顯低于陰性對照組和空白對照組(圖7)。

圖7 Western blot檢測穩轉TGF-β1 siRNA后Eca109細胞的EMT相關蛋白的表達

2.8 MTT檢測穩定轉染TGF-β1 siRNA的Eca109的細胞增殖能力實驗組增殖能力顯著低于陰性對照組和空白對照組，72、96 h時間段組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而空白對照組和陰性對照組細胞增殖能力差異無統計學意義(P>0.05)(圖8)。

圖8 MTT實驗檢測穩轉TGF-β1 siRNA的Eca109細胞增殖能力

2.9 細胞劃痕實驗檢測TGF-β1 siRNA后Eca109的細胞遷移能力實驗組細胞的劃痕愈合能力明顯低于空白對照組及陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。而空白對照組與陰性對照組差異無統計學意義(P>0.05) (圖9)。

圖9 穩轉TGF-β1 siRNA實驗組與空白對照組和陰性對照組的細胞遷移能力試驗

2.10 Transwell侵襲實驗檢測穩轉TGF-β1 siRNA的Eca109的細胞侵襲能力實驗組細胞侵襲能力顯著小于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)。而空白對照組與陰性對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖10)。

3 討論

食管鱗癌是我國常見的惡性腫瘤之一。大部分病人在就診時已處于食管癌晚期，出現了浸潤和轉移，因此從分子水平研究食管癌發生浸潤、轉移的生物學原理更為重要。EMT是多細胞生物胚胎發生、發展中的重要過程，以間質特征的獲得及其上皮細胞極性的喪失為主要特征，在腫瘤的侵襲和遠處轉移過程中發揮了重要的作用。許多相關EMT相關因子如血管生成因子、細胞生長因子等在腫瘤早期促進了EMT的發展。許多研究證實TGF-β1作為生長因子的一種可通過多種途徑促進EMT的進程。已有研究表明TGF-β通過經典的TGF-β/Smad途徑誘導多種基因如HMGA2[5]、Ets1[6]等促進EMT的發展，除了Smads，TGF-β還可介導其他信號通路調節EMT，包括Erk、PI3K-Akt、RhoA、cofilin等[7-8]。

a：細胞侵襲實驗圖示結果(100×)

b: 100倍視野下細胞計數結果

本研究首先在細胞水平探討了TGF-β1生長因子與食管鱗癌的EMT的相關性，進而利用慢病毒轉染的方法干擾TGF-β1的表達后，分別從EMT相關蛋白表達變化以及細胞增殖、細胞遷移、細胞侵襲等方面，從分子水平和細胞功能方面探討了TGF-β1與EMT的關系，以期為進一步深入研究食管癌浸潤轉移機制提供理論基礎。

在癌癥的浸潤、轉移過程中，TGF-β1具有兩面性，在癌癥早期可起到抑癌作用。Kang等[9]研究表明TGF-β可通過Smad通路抑制乳腺的骨轉移； Padua等[10]研究表明TGF-β可通過誘導ANGPTL4的分泌促進乳腺癌細胞向肺部轉移，Gao等[11]研究表明TGF-β可通過抑制BMP的表達促進乳腺癌往遠處的定植轉移，而起到促進EMT的致癌作用。本研究首先從TGF-β1受體方面證明了抑制TGF-β1受體后能夠抑制食管癌的增殖和遷移，并且抑制EMT的發展進程。進而從細胞內干擾TGF-β1的表達后，再次從細胞內證明TGF-β1可以促進食管鱗癌細胞的增殖、遷移、侵襲，促進食管鱗癌發生EMT。

綜上所述，在細胞水平，TGF-β1在食管癌的發生、發展中起到了重要的作用，促進食管鱗癌發生EMT，進一步促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究有待在組織水平和動物水平實驗進行進一步驗證。深入研究EMT對食管癌發生、發展過程中的作用機制，對于尋找食管癌浸潤、轉移的阻斷治療靶點具有重要的意義。

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(本文編輯 楊晨晨)

TGF-β1 promotes esophageal cancer Epithelial-Mesenchymal-Transition process

WANG Dong1,2, LIU Qing2, ZHENG Shutao2, LIU Tao2, DAI Fang2, YANG Chenchen1,LU Xiaomei3, Maimaitiaili Wumaer1

(1XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011,China；2ClinicalMedicalResearchInstitute,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity；3EsophagealCancerResearchInstituteofXinjiangUygurAutonomousRegin,Urumqi830054,China)

Objective To investigate whether TGF-β1 could promote cell proliferation, migration, invasion and epithelial-mesenchymal-transition (EMT) process in Eca109. Methods With stimulation of TGF-β1 receptor inhibitor, the expression of TGF-β1 and EMT-associated mRNAs were detected by qRT-PCR; the expression of EMT-associated proteins were detected by western blot. Then TGF-β1 siRNA was transfected into Eca109 cells by lentiviral vector, the expression level of TGF-β1 was detected by qRT-PCR, EMT-associated proteins were measured by western blot after transfection. MTT, Wound-healing assay and transwell assay were performed to detect cell proliferation, migration and invasion ability. Results Treatment of TGF-β1 receptor inhibitor, TGF-β1 and Vimentin, Snail mRNA were significantly decreased, while the expression of E-cadherin mRNA was increased (P<0.05).EMT-associatedproteinscouldinducethedown-regulationofVimentinexpressionandup-regulatetheE-cadherinexpression.AftertransfectedwithTGF-β1siRNA,themRNAexpressionofTGF-β1andtheproteinexpressionofVimentinweredown-regulated(P<0.05),whiletheproteinexpressionofE-cadherinwasup-regulated.Furthermore,treatmentofTGF-β1receptorinhibitororTGF-β1siRNAinhibitedcellmigration,proliferationandinvasionability.ConclusionThesedatasuggestthatTGF-β1promotesesophagealcancerepithelial-mesenchymal-transitionprocess.

TGF-β1;ESCC;RNAi;cell proliferation; epithelial-mesenchymal-transition (EMT)

國家自然科學基金(81160303，81260359、U1303321); 新疆維吾爾自治區重大科技專項計劃(201430123-1)

王 棟(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：腫瘤分子病理學。

買買提艾力·吾馬爾，男(維吾爾族)，副教授，研究方向：消化道腫瘤的轉化醫學研究，E-mail： dashu_0@qq.com。 盧曉梅，女，博士，教授，研究員，博士生導師，研究方向：消化道腫瘤的轉化醫學研究，E-mail：luxiaomei88@163.com。

R34;R

A

1009-5551(2015)12-1471-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.003

2015-08-30]