食管癌中ERK1/2的功能及其與EMT的相關性分析

劉 清， 劉 濤， 鄭樹濤， 楊晨晨， 王 棟， 戴 芳， 盧曉梅

(1新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院， 烏魯木齊 830054； 2新疆醫(yī)科大學， 烏魯木齊 830011)

·民族腫瘤學·

食管癌中ERK1/2的功能及其與EMT的相關性分析

劉 清1， 劉 濤1， 鄭樹濤1， 楊晨晨2， 王 棟1， 戴 芳1， 盧曉梅1

(1新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究院， 烏魯木齊 830054；2新疆醫(yī)科大學， 烏魯木齊 830011)

目的 探討細胞外信號調節(jié)激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK1/2)信號通路在食管癌中的功能及其對上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的調控作用。方法 實驗組使用ERK1/2磷酸化抑制劑U0126,抑制ERK1/2的磷酸化程度后，陰性對照組為正常培養(yǎng)的Eca109細胞，采用噻唑藍實驗、細胞劃痕以及Transwell實驗分別檢測ERK1/2對食管癌細胞Eca109增殖、遷移和侵襲的影響，通過Western blot實驗檢測ERK1/2對EMT相關蛋白Vimentin表達的影響。結果 U0126作用后，食管癌細胞Eca109增殖受到抑制，遷移速度減慢，侵襲細胞數(shù)顯著減少，同時Vimentin蛋白表達量顯著降低。結論 磷酸化的ERK1/2能夠促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲；磷酸化的ERK1/2能夠調控Vimentin的表達，食管癌中ERK1/2可能參與了EMT過程，從而促進了食管癌細胞的侵襲和轉移。

食管癌； 細胞外信號調節(jié)激酶(ERK1/2)；Vimentin； 上皮間質轉化(EMT)

新疆是食管癌(Esophageal cancer, EC)高發(fā)區(qū)[1]，其中哈薩克族人群食管癌發(fā)病率遠遠高于居住于同一地域的維吾爾族和漢族，同時因侵襲和轉移導致食管癌患者生存期普遍較短，預后較差。

細胞外信號調節(jié)激酶(Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK1/2)又稱P44/42MAPK，屬于MAPK家族，是MAPK通路中的代表激酶[2]。當細胞受外界刺激時，ERK1/2是決定其命運的關鍵性因素，持續(xù)活化的ERK1/2能夠促進細胞增殖以及細胞的惡性轉化，在包括乳腺癌[3]、肺癌[4]、胃癌[5]的多種人類腫瘤中都可發(fā)現(xiàn)ERK1/2的過度激活。

上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤細胞播散和轉移重要的內在機制，其主要特征是上皮細胞失去極性并獲得間質細胞的特性，上皮細胞失去了細胞與細胞之間正常的結構，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等上皮標志物表達受到抑制，細胞之間彼此分離，波形蛋白(Vimentin)、Twist等間質標志分子的表達量增多，細胞獲得活動能力并抵抗凋亡，與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移有著密切的關系[6]。Vimentin是分子量為54 ku的III型中間絲蛋白，是構成細胞骨架的重要成分，其表達改變可以影響細胞的多種生物學行為，Vimentin特異性地分布于間充質來源的細胞，在細胞惡變時，可能反常地表達一些上皮源性的細胞，尤其是上皮源腫瘤細胞，即參與EMT的發(fā)生。多項研究發(fā)現(xiàn)Vimentin與乳腺癌、肝癌、結腸癌、前列腺癌等上皮性惡性腫瘤的侵襲和預后密切相關[7]。

現(xiàn)有研究表明，包括ERK1/2在內的多種信號通路參與EMT過程的調控，同時ERK1/2直接或間接上調Vimentin的表達，從而促進EMT的發(fā)生[8]。本研究旨在探討食管癌中ERK1/2的作用及其對Vimentin表達的調控，初步探討上皮間質轉化對食管癌的調控作用，為進一步深入研究食管癌浸潤、轉移機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料食管鱗癌細胞株Eca109、EC9706購自武漢大學細胞保藏中心。ERK1/2磷酸化抑制劑U0126購自Invitrigon公司，兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2、Vimentin多克隆抗體購自CST公司，兔抗人GAPDH抗體購自Santa Cruz公司，Western blot二抗顯色試劑盒購自Invitrigon公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 食管鱗癌細胞系Eca109、EC9706用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 U0126刺激 按3×105個細胞/孔接種于6孔板，無血清RPMI-1640培養(yǎng)液饑餓12 h，實驗組使用ERK磷酸化抑制劑U0126 50 μM/孔刺激細胞，48 h后收集細胞并提取蛋白。以正常培養(yǎng)的Eca109細胞為陰性對照組。

1.2.3 Western blot檢測U0126刺激后磷酸化ERK1/2及EMT相關蛋白Vimentin在Eca109細胞中的表達 收集U0126刺激后48 h的細胞，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳并轉膜，室溫封閉0.5 h，加入ERK1/2(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)以及內參GAPDH(1∶1 000)抗體，4℃搖床孵育過夜后，加入二抗，室溫孵育2 h，堿性磷酸酶顯色并拍照。

1.2.4 噻唑藍(MTT)檢測U0126刺激后細胞增殖能力 細胞培養(yǎng)及U0126刺激方法同上，按3×104個細胞/孔接種細胞于96孔板。以正常培養(yǎng)的Eca109細胞為陰性對照組。每組設4個復孔。分別于U0126刺激后24、48、72、96 h每孔加MTT(5 mg/mL) 100 μL，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育4 h，棄去MTT，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL，用酶標儀檢測各組細胞490 nm波長處的吸光度。

1.2.5 劃痕實驗檢測U0126刺激后細胞遷移能力 U0126刺激方法同上，按3×105個細胞/孔接種于6孔板，U0126刺激后0 h用10 μL無菌槍頭在每孔底部輕劃1條直線，于0、24、48、72 h在倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度并拍照，觀察不同組別細胞劃痕的愈合速度。

1.2.6 Transwell實驗檢測U0126刺激后細胞侵襲能力 將有基質膠的Transwell小室放入細胞培養(yǎng)板，上室加入預溫后的無血清培養(yǎng)基，37℃孵箱內作用30 min后吸除剩余液體。消化收集U0126刺激48 h后的細胞，無血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，將細胞密度調整至3×105/孔，將細胞懸液加入小室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，擦去上室底部基質膠及未侵襲細胞，固定、并染色，在倒置顯微鏡下觀察、計數(shù)。

2 結果

2.1 同細胞系中磷酸化ERK1/2的表達運用Western blot檢測2種食管癌細胞系中磷酸化ERK1/2的本底表達后發(fā)現(xiàn)，Eca109中磷酸化ERK1/2的表達顯著高于Ec9706細胞(圖1)。本研究后續(xù)均使用Eca109細胞進行U0126刺激后的實驗。

圖1 Western blot檢測食管癌細胞系中磷酸化ERK的本底表達

2.2 ERK1/2對Eca109細胞增殖的影響U0126刺激后48、72、96 h，實驗組吸光度較陰性對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 ERK1/2對Eca109細胞遷移的影響U0126刺激后48、72 h，實驗組劃痕寬度明顯寬于陰性對照組，即實驗組劃痕的愈合速度減慢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

與陰性對照組比較， *P<0.05。

2.4 ERK1/2對Eca109細胞侵襲的影響實驗組侵襲細胞數(shù)[(20±7.3)個]較對照組[(43±6.0)個]明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

與陰性對照組比較, *P<0.05。

與陰性對照組比較, *P<0.05。

2.5 ERK1/2影響上皮間質轉化相關蛋白Vimentin的表達U0126刺激作用抑制了磷酸化ERK1/2的表達，同時上皮間質轉化相關蛋白Vimentin的表達也受到了明顯抑制(圖5)。

3 討論

食管癌嚴重危害哈薩克民族身體健康，其病程進展快，進展轉移是一個極其復雜的調控過程，常導致患者的早期死亡[9]，掌握食管癌的浸潤、轉移機制對提高患者的生存率顯得尤為重要。ERK1/2信號通路的活化在食管癌中呈現(xiàn)上調趨勢，激活ERK1/2的級聯(lián)反應在食管癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。U0126是蛋白激酶MEK有效的選擇性抑制劑，被廣泛用于對ERK信號通路的研究，在非小細胞肺癌中，U0126能夠逆轉TGF-β1介導的上皮間質轉化，并抑制FOXM1基因的表達，也就是說ERK信號通路調控FOXM1表達參與了TGF-β1介導的上皮間質轉化過程[4]；減少Erbin基因的表達能夠增加ERK的磷酸化，促進TGF-β1誘導的上皮間質轉化，包括增加對E-cadherin的抑制，誘導α-肌動蛋白的表達和纖連蛋白的分泌，而U0126的作用能夠抑制上述效應的產(chǎn)生[11]。本研究主要通過U0126抑制食管癌細胞Eca109中的ERK信號通路，進而研究ERK1/2的作用及其對Vimentin表達的調控，初步探討上皮間質轉化對食管癌的調控作用。

圖5 Western blot檢測干擾ERK表達對Vimentin蛋白表達的影響

腫瘤細胞運動、侵襲能力增加，穿透基底膜，侵犯周圍組織、血管并轉移至遠處器官， EMT在這一過程中發(fā)揮了重要的作用，EMT過程中間質細胞標志物Vimentin的表達發(fā)生顯著變化，其表達變化更是與食管癌關系密切：食管癌中Vimentin表達量顯著增加，同時Vimentin高表達與食管癌患者的淋巴結轉移顯著相關[12]；另有研究顯示食管癌中Vimentin的表達與血管侵襲以及預后不良顯著相關[13]?；罨腅RK1/2在EMT介導的腫瘤細胞侵襲、轉移過程中也發(fā)揮重要的作用：c-Met是肝細胞生長因子(HGF)受體，ERK1/2是c-Met下游重要的調控因子，ERK2能夠增強HGF誘導的細胞運動能力，從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[14]；GSK3β的活性受到ERK信號通路的調控，當其活性受到抑制時，Slug的表達增加，E-cadherin的表達受到抑制，即ERK信號通路通過GSK3β間接促進EMT[15]；另有研究報道活化的ERK2能夠使Slug蛋白表達增加，間接促進Vimentin蛋白的表達，最終參與腫瘤細胞的侵襲和轉移[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)抑制ERK1/2的磷酸化程度能夠抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，間接證明磷酸化的ERK1/2能夠促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲；同時發(fā)現(xiàn)，抑制ERK1/2的磷酸化程度后，Vimentin蛋白的表達量顯著減少，即磷酸化的ERK1/2能夠調控Vimentin的表達，也就是說在食管癌中ERK1/2可能參與了EMT過程，從而促進了食管癌細胞的侵襲和轉移，此結果可為進一步闡述食管癌浸潤、轉移的機制奠定基礎，深入探討EMT相關信號通路對食管癌浸潤、轉移的調控作用及其機制，對于食管癌預后的研究具有重要意義。

[1] Zheng S, Vuitton L, Sheyhidin I, et al. Northwestern China:a place to learn more on oesophageal cancer:part one:behaviour and environmental risk factors[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2010, 22:917-925.

[2] Davies RJ. The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway[J]. J Biol Chem,1993,268(20):14553-14556.

[3] Santen RJ, Song RX, McPherson R, et al. The role of mitogen-activated protein (MAP) kinase in breast cancer[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2002, 80(2):239-256.

[4] Kong FF, Zhu YL, Yuan HH, et al. FOXM1 regulated by ERK pathway mediates TGF-β1-induced EMT in NSCLC[J]. Oncol Res, 2014, 22(1):29-37.

[5] Tao C, Lin H, Chen S. The regulation of ERK and p-ERK expression by cisplatin and sorafenib in gastric cancer cells[J]. Gene, 2014, 552(1):106-115.

[6] Huber MA, Kraut N, Beug H, et al. Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression[J]. Curr Opin Cell Biol, 2005, 17:548-558.

[7] Paccione RJ, Miyazaki H, Patel V, et a1. Keratin down regulation in vimentin positive cancer cells is reversible by vimentin RNA interference, which inhibits growth and motility[J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7(9):2894-2903.

[8] Virtakoivu R, Mai A, Mattila E, et al. Vimentin-ERK Signaling Uncouples Slug Gene Regulatory Function[J]. Cancer Res, 2015, 75(11):2349-2362.

[9] Sarah B Umarand， Davied E Fleisher. Esophageal cancer:epidemiology, pathogenesis and prevention[J]. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol, 2008, 5(9):517-526.

[10] Koshy M, Esiashvilli N, Landry JC, et al. Multiple management modalities in esophageal cancer:combined modality management approaches[J]. The Oncol, 2004,9(2):147-159.

[11] Zhou Q, Zeng R, Xu C, et al. Erbin inhibits TGF-β1-induced EMT in renal tubular epithelial cells through an ERK-dependent pathway[J]. J Mol Med (Berl), 2012, 90(5):563-574.

[12] Jin H, Morohashi S, Sato F, et al. Vimentin expression of esophageal squamous cell carcinoma and its aggressive potential for lymph node metastasis[J]. Biomed Res, 2010, 31(2):105-112.

[13] Tanaka M, Kijima H, Shimada H, et al. Expression of podoplanin and vimentin is correlated with prognosis in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Med Rep,2015, 12(3):4029-4036.

[14] Radtke S, Milanovic M, Rosse C, et al. ERK2 but not ERK1 mediates HGF-induced motility in non-small cell lung carcinoma cell lines[J]. J Cell Sci, 2013, 126:2381-2391.

[15] Kim JY, Kim YM, Yang CH, et al. Functional regulation of slug/Snail2 is dependent on GSK-3beta-mediated phosphorylation[J]. FEBS J, 2012, 279:2929-2939.

(本文編輯 楊晨晨)

The association between expression of ERK1/2 and EMT in esophageal squamous cell carcinoma

LIU Qing1, LIU Tao1, ZHENG Shutao1, YANG Chenchen2, WANG Dong1, DAI Fang1, LU Xiaomei1

(1ClinicalMedicalResearchInstitute,theFirstAffliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China;2XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Objective To investigate the role of extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) and its regulation of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC). Methods The experiment group was performed using U0126, and the negative control group was normal cultured Eca109 cells. The effective of ERK1/2 on proliferation, migration and invasion of ESCC cell Eca109 were tested by MTT, wound healing and transwell after dephosphorylated ERK1/2. Expression of vimentin was detected by western blot. Results The proliferation of Eca109 cell was inhibited, the rate of migration was slowed down, and the number of invasive cells was significantly reduced after deal with U0126. Meanwhile, the expression of vimentin was significantly reduced. Conclusion Phosphorylated ERK1/2 contributed to the proliferation, migration and invasion of ESCC cells. Phosphorylated ERK1/2 regulated the expression of vimentin, it may be involved in the EMT process, thus contributing to the invasion and metastasis of ESCC.

ESCC； ERK1/2； vimentin； EMT

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金青年基金(2013211B62)

劉 清(1985-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：腫瘤分子病理學。

盧曉梅，女，博士，教授，研究員，博士生導師，研究方向：消化道腫瘤的轉化醫(yī)學研究，E-mail：luxiaomei88@163.com。

R34; R655.4

A

1009-5551(2015)12-1482-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.006

2015-08-30]