通脈益智顆粒對血管性癡呆模型大鼠的影響*

盧巧喜，過偉峰，李璘，馮靖涵

(1.南京中醫藥大學第二附屬醫院，南京 210004；2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，南京 210046；3.南京中醫藥大學科技處，南京 210046)

通脈益智顆粒對血管性癡呆模型大鼠的影響*

盧巧喜1，過偉峰2，李璘3，馮靖涵2

(1.南京中醫藥大學第二附屬醫院，南京 210004；2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，南京 210046；3.南京中醫藥大學科技處，南京 210046)

目的 觀察通脈益智顆粒對血管性癡呆(VD)模型大鼠的治療效果，探討其作用機制。方法 將大鼠隨機分為6組：假手術組、模型對照組、陽性對照組，通脈益智大、中、小劑量組，均10 mL·kg-1連續灌胃給藥31 d(通脈益智大、中、小劑量組分別給予通脈益智顆粒10.0，5.0，2.5 g·kg-1·d-1，陽性對照組給予吡拉西坦0.375 g·kg-1·d-1，假手術組及模型對照組予0.9%氯化鈉溶液)。除假手術組外，其他各組采用雙側頸總動脈永久性結扎方法制備VD模型。給藥第2，4周采用Y型電迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力；第32天取大鼠海馬組織進行病理學檢查，檢測大鼠血清及海馬組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。結果 與模型對照組比較，通脈益智各劑量組大鼠電迷宮實驗潛伏期明顯縮短，學習記憶正確率提高(P<0.05或P<0.01)，血清及海馬組織SOD活性顯著增高(P<0.01)，MDA含量明顯降低(P<0.01)。病理學檢查結果顯示，模型對照組海馬神經元排列紊亂，錐體細胞明顯減少。與模型對照組比較，通脈益智各劑量組大鼠海馬神經元病變減輕。結論 通脈益智顆粒可顯著改善VD模型大鼠學習記憶能力，提高血清及海馬組織SOD活性，降低MDA含量，有效清除自由基，減輕海馬錐體細胞受損程度。

通脈益智顆粒；癡呆，血管性；學習能力；記憶能力；超氧化物歧化酶；丙二醛；錐體細胞

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是一種由多種腦血管病(缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病等) 引起的腦功能障礙而產生的一組獲得性嚴重認知功能缺陷或衰退的臨床綜合征[1]。近年來，VD發病率呈上升趨勢，已成為嚴重影響老年人生活質量的重要疾病之一。通脈益智顆粒臨床治療VD有效，能改善患者認知功能，延緩病情進展[2-4]。筆者在本研究中采用雙側頸總動脈結扎法復制大鼠VD模型，觀察通脈益智顆粒對VD大鼠的治療作用，以期進一步探索該藥作用機制，為其研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠90只，體質量(225±25)g，雄性，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK(滬)2012-0002，合格證號：2007000540510。給藥前后大鼠分籠飼養，全價顆粒飼料喂養，自由飲水。實驗室溫度(22±2) ℃，相對濕度50%～70%，備有中央空調和空氣過濾機械設備。

1.2 藥物 通脈益智顆粒(由制首烏、益智仁、遠志、水蛭、川芎等組成，每毫升浸膏相當于生藥4 g，由南京中醫藥大學中藥復方分離工程重點實驗室提供，批號：20120723)，吡拉西坦片(金陵藥業股份有限公司利民制藥廠生產，批號：120801，規格：每片0.4 g)，0.9%氯化鈉注射液(中國大冢制藥有限公司生產，批號：2C81F4，規格：每袋500 mL)；注射用青霉素鈉(山東魯抗醫藥股份有限公司生產，批號：L120324)；烏拉坦(上海青析化工科技有限公司生產，批號：100228，規格：每瓶500 g)。

通脈益智中劑量(5 g生藥·kg-1)相當于臨床等效劑量(人臨床日用量為生藥48 g，按體質量60 kg計算，用藥量為生藥0.8 g·kg-1)，將通脈益智浸膏按大、中、小劑量分別配成含藥量為1.00，0.50，0.25 g·mL-1溶液，吡拉西坦配成0.037 5 g·mL-1溶液。

1.3 儀器與試劑 ACS系列天平(中國凱豐集團)，AUY120型電子分析天平(日本島津SHIMADZU公司)，MG-2C/3C型大鼠迷宮刺激器(張家港市生物醫學儀器廠)，GS-15R型臺式冷凍離心機(美國Beckman公司)，AU5400型全自動生化分析儀(日本奧林帕斯OLYMPUS公司)。丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(批號：A003-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒(批號：A001-1)均由南京建成生物工程研究所提供。

1.4 模型的建立 采用雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型，10%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉大鼠，1 g·kg-1，仰臥位固定在手術臺上，常規備皮消毒，頸正中切口，分離雙側頸總動脈(common carotid artery，CCA)，3號手術線結扎雙側頸總動脈，縫合切口。假手術組僅分離頸總動脈而不結扎。將假手術組大鼠和造模大鼠分開。術后均肌內注射青霉素鈉，2萬U·kg-1[5]。

1.5 分組及給藥 術后第4天，對造模的大鼠進行電迷宮實驗，按迷宮實驗結果篩選記憶障礙大鼠，造模后存活大鼠60只，按電迷宮實驗結果編號排序，采用SPSS軟件分組。與給予假手術的大鼠比較，造模大鼠潛伏期和學習記憶正確率均差異有統計學意義。將模型大鼠分為模型對照組，陽性對照組，通脈益智大、中、小劑量組。通脈益智大、中、小劑量組按10.0，5.0，2.5 g·kg-1·d-1灌胃通脈益智顆粒，陽性對照組按0.375 g·kg-1·d-1灌胃吡拉西坦，模型對照組及假手術組灌胃0.9%氯化鈉溶液。給藥體積均為10 mL·kg-1。均每天8：00～ 10：00給藥1次，連續31 d。

1.6 電迷宮實驗 給藥開始后第14，15天及第28，29天進行電迷宮實驗，檢測大鼠學習記憶情況。方法如下：Y型電迷宮裝置有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂，3臂中均有15 W燈泡，實驗時將Ⅰ臂作為起步區，Ⅱ臂為電擊區，Ⅲ臂為安全區(燈泡亮)，設置電壓36 V，實驗時保持房間黑暗。將大鼠放入起步區適應5 min，按下Ⅲ鍵，Ⅲ臂燈光亮為安全區，大鼠直接逃避到安全區為正確反應，燈光再保留10 s，然后熄燈完成一次測試。大鼠到達安全區的支臂為下一次測試的起步位置，兩次訓練間隔30 s，共15次。記錄正確反應次數及每次從電擊開始至到達安全區的時間，作為潛伏期。將當天成績作為學習成績。24 h后重復以上實驗，作為記憶成績。

1.7 取材方法及指標檢測

1.7.1 取材 ①血清：實驗第32天，10%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉大鼠，1 g·kg-1，剖開腹腔，暴露腹主動脈，注射器抽取血液4 mL置試管，3 000 r·min-1離心10 min(r=6 cm)，取上清液保存于冰箱待測。②海馬組織：將大鼠處死，迅速取出大腦，置冰盤上分離海馬組織，冰冷0.9%氯化鈉溶液沖洗、吸干。取部分海馬組織制成勻漿，3 500 r·min-1離心10 min(r=6 cm)，取上清液待測；另取部分海馬以10%甲醛固定，常規石蠟包埋，切片厚4～5 μm，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光鏡下觀察海馬組織形態變化。

2 結果

2.1 電迷宮實驗結果 見表1。與假手術組比較，模型對照組大鼠潛伏期明顯延長(P<0.01)，學習和記憶正確率明顯降低(P<0.01)，提示模型對照組大鼠存在明顯的學習記憶障礙。與模型對照組比較，給藥后第14，15天，通脈益智中、大劑量組及陽性對照組潛伏期均明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，通脈益智中劑量組及陽性對照組記憶正確率顯著提高(P<0.05)；給藥后第28，29天，通脈益智各劑量組及陽性對照組的學習和記憶正確率均顯著增加，潛伏期明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，通脈益智大劑量組學習和記憶正確率與假手術組比較，差異無統計學意義。說明通脈益智顆粒對VD大鼠的學習記憶能力有明顯改善作用。

表1 6組大鼠電迷宮實驗學習記憶成績比較

與假手術組比較，*1P<0.01，*3P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.05，*4P<0.01

Compared with sham operation group，*1P<0.01，*3P<0.05；compared with model control group，*2P<0.05，*4P<0.01

2.2 血清及海馬組織SOD活性、MDA含量 見表2。與假手術組比較，模型對照組大鼠血清及海馬組織SOD活性下降(P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)，提示模型對照組大鼠海馬組織自由基生成增加，清除自由基能力下降，引起腦損傷，導致學習記憶功能障礙。通脈益智中、大劑量組血清SOD活性顯著提高，MDA含量顯著降低，與模型對照組比較，均差異有統計學意義(P<0.01)。通脈益智各劑量組海馬組織中SOD活性顯著提高，MDA含量顯著降低，與模型對照組比較，均差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 形態學檢測 光鏡下可見模型對照組大鼠海馬神經元腫脹，空泡變性，細胞核固縮，形態正常錐體細胞數量減少，排列紊亂。假手術組大鼠海馬神經元未見腫脹、空泡變性，核正常，錐體細胞排列整齊。通脈益智各劑量組及陽性對照組大鼠海馬神經元腫脹、空泡變性程度較模型對照組輕，形態正常錐體細胞數量較模型對照組增多，且排列較整齊(圖1)。

3 討論

VD主要表現除了神經系統定位損害的癥狀和體征外，還有執行能力、定向力、記憶力、計算力、語言、視空間技能、人格等認知功能受損。VD治療方面，單一作用點的藥物很難取得滿意效果，而中藥治療VD具有多途徑、多靶點的特征，契合了該病復雜性、綜合性的發病機制，并在臨床和動物實驗上取得了較滿意的效果[6-7]。通脈益智顆粒是治療VD的臨床經驗方，其中制首烏、益智仁補腎益精，遠志化痰開竅，輔以川芎、水蛭活血化瘀通脈，諸藥相伍共奏益腎化痰、活血祛瘀之功。

目前有多種慢性腦缺血模型制作方法，如四血管阻斷法(4-VO)、兩血管阻斷法(2-VO)、栓塞法、腦血管定位阻斷法等。綜合手術復雜程度、感染機會等因素，筆者在本實驗中采用目前最常用的永久性結扎雙側頸總動脈(2VO)方法制備VD大鼠模型。該模型較好地模擬了人類因動脈粥樣硬化、動脈管腔狹窄等因素導致的VD。但此方法對動物創傷大，死亡率偏高。故本實驗過程中保持室溫，選擇體質量達標的健康雄性大鼠，且實驗人員技術成熟，可減少大鼠死亡。

表2 6組大鼠血清及海馬組織SOD、MDA含量比較

與假手術組比較，*1P<0.01，*3P<0.05；與模型對照組比較，*2P<0.01

Compared with sham operation group，*1P<0.01，*3P<0.05；compared with model control group，*2P<0.01

A.模型對照組；B.假手術組；C.陽性對照組；D.通脈益智大劑量組；E.通脈益智中劑量組；F.通脈益智小劑量組

A.model control group；B.sham operatedion group；C.positive control group；D.high doseTongmaiYizhigroup；E.middle doseTongmaiYizhigroup；F.low doseTongmaiYizhigroup

Fig.1 Histopathologic changes of hippocampus in six groups of rats(HE，×100)

學習記憶障礙是VD的主要臨床特征之一。在VD動物實驗中，目前多數采用建立條件反射的方法來測試動物學習記憶能力，如用Y型電迷宮實驗、Morris 水迷宮實驗等測定VD模型動物空間學習記憶能力[8]。本研究顯示，通脈益智各劑量組VD模型大鼠電迷宮實驗潛伏期明顯縮短，大鼠學習記憶的正確率提高，說明在Y型電迷宮實驗中通脈益智顆粒能明顯改善VD模型大鼠的學習記憶能力。但隨藥物劑量的增加，其正確率升高幅度較小，潛伏期縮短不明顯，提示量效關系不明顯。其原因可能與藥物濃度、給藥時間、劑量界定等有關，后續研究中應注重方劑量效曲線關系的研究。

VD發病機制復雜，目前認為其發生與細胞內鈣超載、神經遞質及興奮性氨基酸釋放異常、自由基損傷、炎癥反應、腦血流異常、缺血后神經元凋亡等有關[9]。因腦組織含有大量不飽和脂肪酸，所以最容易受到自由基攻擊。當腦組織處于缺血、缺氧狀態時，細胞內鈣超載產生大量自由基，過量消耗自由基清除酶，使得自由基急速堆積，損傷細胞生物膜，促使細胞老化甚至死亡，腦組織損傷進一步加重[10]。反映氧自由基代謝的常見指標有MDA、SOD、過氧化氫酶(catalase，CAT)、還原型谷胱甘肽(L-glutathione，GSH)等。其中MDA 是脂質過氧化物的分解產物，其含量反映了組織細胞損傷的程度，SOD是腦組織內阻止自由基產生的酶類物質，腦組織缺血、缺氧時，產生大量自由基，導致這些酶活性下降。本研究結果顯示：通脈益智顆粒中、大劑量組血管性癡呆大鼠血清及海馬組織SOD活性明顯提高，MDA含量降低，表明通脈益智顆粒可有效清除自由基，減輕脂質過氧化損傷，從而減輕或消除自由基在不同環節上對缺血后神經元的不利影響。

海馬區是腦缺血最敏感的區域，是腦內參與記憶儲存功能的重要部分，其中 CA1區更易受損，海馬CA1區細胞損傷的動物，記憶力明顯下降[11]。本研究顯示，通脈益智各劑量組大鼠海馬神經細胞、錐體細胞排列較模型對照組整齊，說明通脈益智顆粒能減輕海馬錐體細胞的受損程度，保護腦神經元，改善腦缺血造成的病理損傷。

綜上所述，通脈益智顆粒可顯著改善VD模型大鼠學習記憶能力，提高血清及海馬組織SOD活性，降低MDA含量，有效清除自由基，減輕海馬錐體細胞受損程度，從而改善腦缺血造成的病理損傷，這可能是其治療VD的作用機制之一。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.002

Effects ofTongmaiYizhiGranules on Vascular Dementia in Rats

LU Qiaoxi1，GUO Weifeng2，LI Lin3，FENG Jinghan2

(1.TheSecondAffiliatedHospital，NanjingTraditionalChineseMedicineUniversity，Nanjing210004，China；2.TheFirstClinicalMedicalCollege，NanjingTraditionalChineseMedicineUniversity，Nanjing210046，China；3.DepartmentofScienceandTechnology，NanjingTraditionalChineseMedicineUniversity，Nanjing210046，China)

Objective To study the therapeutic effects and related mechanism ofTongmaiYizhigranules on vascular dementia in rats. Methods Bilateral carotid artery ligation was used to establish rat model of vascular dementia (VD).The rats were randomly divided into 6 groups: sham operated，the model control，piracetam (0.375 g·kg-1·d-1) as positive control，low dose (2.5 g·kg-1·d-1)，middle dose(5.0 g·kg-1·d-1)，and high dose (10.0 g·kg-1·d-1) ofTongmaiYizhigranules.Each group was intragastrically administered with 10 mL·kg-1of corresponding medications for 31 days after the VD model was established.The sham group was given with 0.9% NaCl solution.Y-electric maze was used to test the learning and memory function of rats at the second and fourth weeks.On the day 32，hippocampal tissues were collected for pathological analysis by microscope.The activities of SOD and content of MDA in serum and tissue homogenate were tested. Results Compared with model control group，each dose ofTongmaiYizhigranules obviously shortened the incubation period of VD rats in electric maze test，and accuracy of learning and memory was improved (P<0.05 orP<0.01).The activity of SOD was decreased，and the content of MDA was increased after treatment withTongmaiYizhigranules (P< 0.01).Hippocampal neuronal cells were disarranged，and the number of cone cells was decreased significantly in the model control group.In contrast，the necrosis and degeneration of hippocampal neurons were alleviated in allTongmaiYizhitreatment groups. ConclusionTongmaiYizhigranule can apparently improve learning and memory function of VD rats.It can also improve the activity of SOD and reduce the content of MDA in serum and hippocampus，effectively remove free radicals，and alleviate the injury of hippocampal pyramidal cells.

TongmaiYizhigranules; Dementia, vascular；Learning function; Memory function；Superoxide dismutase；Malondialdehyde；Pyramidal cells

2014-02-17

2014-03-20

*康緣中醫藥科技創新基金(HZ1005KY)

盧巧喜(1986-)，女，江蘇東臺人，碩士，研究方向：中醫內科學(神經內科)。E-mail：249486090@qq.com。

過偉峰，教授，博士，研究方向：神經內科。電話：025-85811642，E-mail：576021241@qq.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)03-0289-05