丹參多糖提取工藝優選與含量測定*

包華音，劉楊，萬鵬

(山東中醫藥大學，濟南 250355)

丹參多糖提取工藝優選與含量測定*

包華音，劉楊，萬鵬

(山東中醫藥大學，濟南 250355)

目的 優化丹參多糖提取工藝，測定不同產地丹參藥材多糖含量。方法 采用正交實驗設計法，以丹參藥材中多糖含量為指標，確定多糖提取的最佳工藝，采用苯酚-硫酸法對不同產地丹參藥材的多糖含量進行測定。結果 建立了丹參藥材多糖的最優提取工藝：加入溶劑量20倍，藥材粉末回流提取50 min，提取3次，醇沉濃度為70%。不同產地的丹參藥材多糖含量差異無統計學意義。結論 優化的提取工藝穩定、合理、可行，為丹參藥材多糖活性的進一步研究和藥材質量評價提供了可靠的實驗依據。

丹參多糖；正交實驗；苯酚-硫酸法

丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的根，味苦，性微寒，具有活血化瘀、通經止痛、清熱安神的功效[1]。研究表明，丹參多糖具有較好的免疫調節保護活性，能減少尿蛋白的排泄，抑制血清膽固醇和脂質過氧化物濃度的提高，改善血清清蛋白與球蛋白比值，并對小鼠急性肝損傷有顯著保護作用[2-4]。丹參多糖能明顯增加心肌細胞抗增殖蛋白(prohibitin)表達，有效保護過氧化氫(H2O2)導致的細胞損傷[5]。因此，研究丹參多糖成分在中藥資源開發和藥材質量評價方面具有重要意義。筆者在本研究中通過正交實驗設計優選丹參藥材多糖提取工藝，并對不同產地丹參藥材的多糖含量進行測定，以期為丹參多糖的進一步研究和藥材質量評價提供科學的實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CP225D型電子天平(上海越平科學儀器有限公司，感量：0.01 mg)，SL型恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)，TL-1型醫用離心機(姜堰市天力醫療器械有限公司)，UV-9000型紫外-可見分光光度計(上海云析儀器有限公司)，101-OA型數顯式電熱恒溫干燥箱(上海佰奧生物科技有限公司)。

1.2 試劑 95%乙醇(天津科盟化學試劑有限公司生產，批號：20110427)、D-葡萄糖標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200302，含量：99.5%)、濃硫酸(萊陽市康德化工有限公司，批號：20091210)、苯酚(上海化學試劑公司，批號：W991116)均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 藥材 藥材經山東中醫藥大學李峰教授鑒定為丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根，粉碎過四號篩(篩孔內徑<250 μm)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制 取D-葡萄糖對照品100.00 mg精確稱定，加水溶解并定容至100 mL，得對照品溶液(葡萄糖濃度為1.000 0 mg·mL-1)。

2.2 標準曲線的繪制 分別精密吸取對照品溶液0，20，40，60，80，100 μL于具塞試管中，加水補至2.0 mL，各加入6%的苯酚溶液1.0 mL，混勻。迅速加入濃硫酸5.0 mL混勻，放置5 min。將試管置于沸水浴中15 min，取出冷至室溫。以第1支試管中溶液為空白對照，按照分光光度法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄VA)，在490 nm波長處測定其余5支試管中溶液的吸光度。以葡萄糖含量為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為：Y=0.016 2X-0.003 4(r=0.999 1)，線性范圍0～100 μg。

2.3 多糖提取正交實驗設計 本實驗選取4個影響因素：料液比(A)、醇沉濃度(B)、提取時間(C)、提取次數(D)，每個因素設3個水平，選用L9(34)正交表，以多糖含量為指標進行實驗。因素水平見表1。

表1 丹參藥材多糖提取工藝優選因素L9(34)水平表

水平料液比(A)/倍醇沉濃度(B)/%提取時間(C)/min提取次數(D)111060501212070702313080903

2.4 供試品溶液的配制 向丹參藥材粉末中加入A倍量水并稱定。回流提取C(min)，室溫冷卻后稱定并補足失質量，過濾。向藥渣中加入A倍量水重復回流提取D次。合并濾液，濃縮至初始水溶液體積。精密吸取濃縮液2 mL，加入95%乙醇至溶液乙醇濃度為B，混勻，靜置1 h。4 000 r·min-1離心10 min，將沉淀用1 mL水溶解。向溶液中加入Sevag試劑(三氯甲烷：正丁醇= 4：1)2 mL，混勻，4 000 r·min-1離心10 min。將上清液轉至刻度試管中，加水補至2 mL，混勻得供試品溶液。

2.5 最佳提取工藝確定 正交實驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 L9(34)正交實驗安排與結果

A：料液比；B：醇沉濃度；C：提取時間；D：提取次數

表3 方差分析表

從表3可見，FA=39.520，FB=8.508，FD=4.442，均P<0.05。按a=0.05檢驗水準，可認為因素A、B、D均有顯著性，為主要影響因素；FC=1.002，P﹥0.05，因此因素C無顯著性，為次要影響因素。結合表2數據，A、B、D均數估計取最高者，由于因素C無顯著性，所以在經濟的條件下選擇提取時間最少者，得最佳提取工藝為A2B2C1D3，即溶劑量為20倍，醇沉濃度為70%，回流提取50 min，提取3次。

2.6 精密度實驗 精密吸取對照品溶液40 μL，加水補至2.0 mL，按照“2.2”項中的方法制備待測液，并測定吸光度。重復操作6次，RSD為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性實驗 根據確定的提取工藝制備供試品溶液，按照“2.2”項下方法于5，10，15，20，25，30 min時測定吸光度，RSD=1.11%，結果表明供試品溶液在30 min內測定穩定。

2.8 重復性實驗 根據確定的提取工藝制備供試品溶液，平行處理6份，每份2.0 mL，按“2.2”項下方法測定吸光度。RSD =1.41%，結果表明樣品測定符合技術要求，重復性良好。

2.9 加樣回收率實驗 精密稱取丹參樣品6份各3.000 0 g，各加入葡萄糖對照品5.5 mg，按照“2.4”項方法制備供試品溶液，測定吸光度并計算加樣回收率，結果見表4。平均加樣回收率96.32%，RSD=1.14%(n=6)，加樣回收率符合技術要求。

表4 葡萄糖加樣回收率實驗結果

2.10 最佳工藝驗證實驗 按照篩選出的最佳提取工藝，提取3批樣品進行驗證實驗，根據標準曲線計算出樣品中以葡萄糖計的總多糖含量(mg·g-1)，分別為1.493 8，1.512 3，1.524 7，RSD為1.19%，結果表明此工藝穩定、可行。

2.11 不同產地丹參藥材多糖的含量測定 按“2.4”項下方法，根據確定的提取工藝分別制備不同產地丹參藥材的供試品溶液，平行處理3份，每份2.0 mL，按“2.2”項方法測定吸光度，根據標準曲線計算出藥材中的多糖含量。結果見表5。

從表5可見，本研究中不同產地丹參多糖含量存在一定差異，含量高低順序為：陜西洛南>河南南陽>山東平邑>山東沂源>河南盧氏>山東煙臺>山東煙臺航天>山東蒙陰>山東臨朐。其中，陜西洛南的多糖含量最高，為1.83 mg·g-1，是山東臨朐多糖含量的1.5倍。

3 討論

經過前期實驗比較，回流提取的丹參多糖含量顯著高于超聲提取，因此本研究采用回流方式提取丹參多糖。

通過正交實驗優選出丹參藥材中多糖的提取工藝為：以20倍量的水回流提取藥材粉末50 min，提取3次，合并提取液濃縮，乙醇醇沉濃度70%。該工藝能更加準確地反映丹參藥材中多糖的含量，減少測定誤差。

表5 不同產地丹參藥材的多糖含量n=3

水提醇沉法是利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質提純多糖工藝成本低、安全，目前在多糖提取中廣泛應用[6]。但由于水的極性大，容易把蛋白質等成分提取出來，因此本研究中選擇用Sevag法去除蛋白質[7]。

研究表明，蒽酮-硫酸法穩定性較差，而苯酚-硫酸法較為穩定，是較為理想的多糖含量測定方法[8]。本研究采用苯酚-硫酸法對多糖含量進行測定，簡單、快捷、靈敏，經過方法學考察，測定結果穩定、可靠。

丹參多糖具有提高免疫力、抑制腫瘤細胞生長、抗疲勞、降血脂等多種生物活性[9-10]，具有廣闊的研究和開發前景，對丹參藥材的多糖含量進行測定在丹參藥材質量評價方面具有重要意義。本研究中不同產地丹參藥材中多糖含量不同，但差異無統計學意義。這可能與丹參為我國常用大宗藥材之一，具有完善的栽培加工技術有關。

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[9] 吳從平.丹參多糖的提取及生物活性的研究[D].泰安：山東農業大學，2010：44-50.

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.032

2013-11-03

2014-01-20

*山東省農業良種工程重大課題(2011LZ01-03)

包華音(1979-)，女，山東榮成人，副教授，博士，研究方向：中藥質量控制與資源研究。E-mail：baohuayin@163.com。

萬鵬(1961-)，男，山東濟南人，高級實驗師，研究方向：生藥學。E-mail：wanpeng0429@163.com。

R286；TQ460.1

B

1004-0781(2015)03-0404-03