毛果算盤子提取工藝及沒食子酸含量測定*

黃紅泓，甄漢深，柳賢福

(1.廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，南寧 530222；2.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001)

毛果算盤子提取工藝及沒食子酸含量測定*

黃紅泓1，甄漢深2，柳賢福1

(1.廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，南寧 530222；2.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001)

目的 建立測定廣西不同產地毛果算盤子中沒食子酸含量的高效液相色譜(HPLC)法。方法 采用正交實驗優化毛果算盤子的提取工藝，用HPLC法測定毛果算盤子中沒食子酸的含量。色譜柱為Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(10：90)，檢測波長為270 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。結果 沒食子酸在0.031～0.186 μg呈良好的線性關系(r=0.999 9)，平均加樣回收率為102.81%，RSD為2.05%(n=9)。結論 所建立的方法簡單、穩定、重復性好，可用于毛果算盤子藥材的質量控制。

毛果算盤子；沒食子酸；提取工藝；含量測定；色譜法，高效液相

毛果算盤子為大戟科植物毛果算盤子(GlochidioneriocarpumChamp.)的干燥地上部分，別名毛七公、漆大伯、兩面毛、漆大姑。味苦、澀，性平，全年可采收。具有驅風利濕、散瘀、止血、消腫的功效，用于急性胃腸炎、痢疾、風濕性關節痛、跌打損傷、創傷出血、濕疹、漆瘡、皮炎等的治療[1]。其含有酚類、鞣質類[1-3]和三萜類化合物，以及微量元素。韋松基等[4]對毛果算盤子和算盤子的顯微特征進行了比較研究。劉布鳴等[5-6]采用薄層色譜研究表明，漆大姑藥材與沒食子酸對照品色譜在相應的位置上顯相同顏色斑點，并從漆大姑中分離出沒食子酸類化合物。

已有文獻證實沒食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化等多種生物學活性[7]，對血管亦有收縮作用[8]。沒食子酸為毛果算盤子主要成分之一，其生物學活性與文獻記載的毛果算盤子功效相似，故選擇沒食子酸成分為含量測定指標。目前文獻報道只有用薄層掃描法測定漆大姑中沒食子酸的含量，筆者尚未見高效液相色譜(HPLC)法測定的報道。因此，筆者在本實驗中建立毛果算盤子中沒食子酸的HPLC測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫Agilent1200高效液相色譜儀，可變波長檢測器(G-1313A)。LG16-W高速微量離心機(北京醫用離心機廠)，SB3200T超聲波清洗儀(上海能信超聲有限公司)，Millipore Simplicity-185超純水儀(美國密里博公司)，BP211D電子分析天平(德國賽多利斯，精度：0.01 mg)。

1.2 試藥 沒食子酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-200803，供含量測定)。甲醇(美國Fisher科學世界公司，批號：A372-4)、乙腈為色譜純(美國Fisher科學世界公司，批號：A943-4)，其余試劑為分析純(北京化工廠)。毛果算盤子藥材于2012年4月采自廣西10個地區，分別經廣西中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室寧小清副教授及廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院生藥教研室苑敏副教授鑒定，均為大戟科植物毛果算盤子(GlochidioneriocarpumChamp.)的干燥地上部分(表1)。標本存放于廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院標本室。

表1 毛果算盤子藥材編號與產地

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(10：90)；檢測波長270 nm；流速為1.0 mL·min-1。柱溫20 ℃；進樣量5 μL。

2.2 溶液的制備 取105 ℃干燥至恒重的沒食子酸對照品1.55 mg，精密稱定，置25 mL量瓶，加甲醇適量使溶解并定容，搖勻，即得濃度為0.062 mg·mL-1沒食子酸對照品溶液。取毛果算盤子藥材粉末約1 g，精密稱定，精密加入甲醇40 mL，稱重，靜置12 h，超聲提取40 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液于離心管，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液5 μL，注入液相色譜儀測定，即得。

2.3 專屬性實驗 分別精密吸取上述沒食子酸對照品溶液和毛果算盤子供試品溶液各5 μL進樣分析，結果見圖1。沒食子酸的保留時間為6.0 min，與各自相鄰峰的分離度>1.5。

1.沒食子酸

圖1 沒食子酸對照品(A)和毛果算盤子樣品(B)HPLC色譜圖

2.4 供試品處理的正交實驗 根據沒食子酸的性質及初步預實驗結果，采用正交實驗L9(34)進行毛果算盤子的甲醇超聲提取工藝研究，以沒食子酸的含量為評價指標，正交設計表及分析結果見表2～4。

表2 正交設計因素水平表

A：甲醇濃度，B：甲醇用量，C：提取時間

因素極差R越大，說明因素的水平改變對實驗結果影響越大。由實驗結果的直觀分析及方差分析可知，影響沒食子酸提取效果的因素大小順序為A>B>C，即甲醇濃度>甲醇用量>提取時間，其中甲醇濃度和甲醇用量對實驗結果有顯著性影響，根據實驗結果確定最佳提取方法為A3B3C2，即用100%甲醇40 mL超聲處理40 min。

表3 沒食子酸L9(34)正交實驗表與結果

A：甲醇濃度，B：甲醇用量，C：提取時間

為進一步考察優選工藝的可靠性和穩定性，取3份S1號樣品粉末，按上述最優工藝條件A3B3C2進行驗證實驗，按“1.2.1”項所述方法進行測定，結果沒食子酸含量為0.93，0.91，0.89 mg·g-1。平均含量0.91 mg·g-1，RSD=1.98%。與正交實驗方案中的最高值相同，說明優化成功。

表4 沒食子酸方差分析表

A：甲醇濃度，B：甲醇用量，C：提取時間

2.5 線性關系考察 精密吸取“2.2”項對照品溶液1，2，3，4，5，6 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，分別取上述6個不同濃度的對照溶液5 μL注入高效液相色譜儀，按“2.4”項色譜條件測定其峰面積。以對照品溶液進樣量(μg)為橫坐標，其色譜峰峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，得出沒食子酸回歸方程為Y=3 090.8X+1.0，r=0.999 9；結果表明沒食子酸在進樣量為0.031～0.186 μg之間呈良好的線性關系。

2.6 精密度實驗 精密吸取S1供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件，連續進樣6次，測定樣品中沒食子酸的峰面積。結果測得樣品中沒食子酸峰面積RSD為1.09%，表明所用液相色譜儀的精密度較好。

2.7 重復性實驗 取S1毛果算盤子藥材粉末1 g，精密稱定，共取6份，按“2.2”項供試品制備方法制備， 精密吸取供試品溶液5 μL，按“2.1”項色譜條件進行測定，計算沒食子酸含量，RSD為2.02%。結果表明，用上述方法測定沒食子酸的含量，重復性好。

2.8 穩定性實驗 取S1毛果算盤子藥材粗粉約1 g，精密稱定，按“2.2”項供試品制備方法制備，室溫下保存，分別在0，2，6，10，16，24 h精密吸取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項色譜條件測定，考察穩定性。結果測得樣品中沒食子酸峰面積RSD值為1.47%，表明供試品溶液在24 h內保持穩定。

2.9 加樣回收率實驗 取已知含量S1號樣品粉末約0.5 g，精密稱定，精密加入甲醇40 mL，精密加入沒食子酸0.37，0.45，0.56 mg(加入量為樣品含量的80%，100%和120%)。按“2.2”項供試品制備方法制備，各平行制備3份，分別測定含量，計算加樣回收率(毛果算盤子藥材沒食子酸含量以0.91 mg·g-1計)，結果見表5。實驗結果可知，沒食子酸的平均加樣回收率為102.81%，RSD=2.05%。

表5 毛果算盤子加樣回收實驗結果n=9

2.10 樣品測定 分別取廣西不同產地(2012年4月份采收)毛果算盤子藥材粉末(每個產地各3份)約1 g，精密稱定，精密加入甲醇40 mL，稱質量，靜置12 h，超聲提取40 min，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液于離心管，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液5 μL，注入液相色譜儀測定，即得。用標準曲線法計算，實驗結果見表6。

表6 不同產地毛果算盤子藥材含量測定結果n=3

3 討論

筆者在本實驗中采用HPLC法測定毛果算盤子中沒食子酸的含量，該方法簡單，質量控制方法切實可行，可在一定程度上反映毛果算盤子藥材的質量。

不同產地的毛果算盤子中的沒食子酸含量差異較大。從不同產地毛果算盤子藥材含量測定結果可以看出，1，7號產地的毛果算盤子中沒食子酸的含量較高。

本文在前期單因素考察實驗中發現，甲醇的濃度越高提取效果越好，在50%甲醇提取條件下，提取效果并不佳。而在甲醇達到80%才能達到一定的提取效果，且每上一個10%濃度梯度，提取的效果存在顯著差異。本實驗設定了甲醇80%，90%，100%3個濃度進行正交實驗，結果顯示100%甲醇提取效果最佳，且甲醇濃度對實驗結果影響差異有統計學意義。

[1] 江蘇新醫學院.中藥大詞典(下冊)[M].上海：上海人民出版社，1977：2574.

[2] 廣州市藥品檢驗所.農村中草藥制劑技術[M].北京：人民衛生出版社，1971：233.

[3] 廣西壯族自治區衛生廳.廣西中藥材標準(第2冊)[M].南京：廣西科學技術出版社，1996：281.

[4] 韋松基，陳建霞，韓劍.毛果算盤子與算盤子的顯微鑒別[J].廣西中醫藥，2007，30(1)：59-60.

[5] 劉布鳴，陳榮光，韋汝武，等.漆大姑中沒食子酸的分離鑒定與薄層色譜鑒別[J].廣西科學，1999， 6 (3)： 203-204.

[6] 劉布鳴，陳榮光，蔡全玲.漆大姑化學成分的初步研究[J].廣西中醫藥，2000， 23(1)：52-54.

[7] 李肖玲，崔嵐，祝德秋.沒食子酸生物學作用的研究進展[J].中國藥師，2004，7(10)：767-769.

[8] YOSHINO M，HANEDA M，NARUSE M，et al.Prooxidant action of gallic acid compounds： copper-dependent strand breaks and the formation of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine in DNA[J].Toxicol In Vitro，2002，16(6)：705-709.

DOI 10.3870/yydb.2015.03.029

2014-01-21

2014-02-15

*廣西高校科學資助項目(LX2014668)

黃紅泓(1977-)，女，廣西梧州人，講師，碩士，從事藥學和中藥學教學和科研工作。電話：0771-4736399，E-mail：929762704@qq.com。

R286；R927.1

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1004-0781(2015)03-0392-03