HPLC梯度洗脫法同時測定瀉痢寧片中秦皮甲素秦皮乙素黃芩苷和鞣花酸含量

文才華

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院藥劑科，南寧 530021)

HPLC梯度洗脫法同時測定瀉痢寧片中秦皮甲素秦皮乙素黃芩苷和鞣花酸含量

文才華

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院藥劑科，南寧 530021)

目的 采用高效液相梯度洗脫法測定瀉痢寧片中秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸的含量。方法 Hypersil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為甲醇-乙腈(4：1)，流動相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫；流速：1.1 mL·min-1；檢測波長λ1=334 nm(檢測秦皮甲素和秦皮乙素)，檢測波長λ2=280 nm(檢測黃芩苷)，檢測波長λ3=254 nm(檢測鞣花酸)。結果 秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸分別在0.058 6～1.172 0 μg(r=0.999 2)、0.015 4～0.308 0 μg(r=0.999 8)、0.447 2～8.944 0 μg(r=0.999 6)、0.072 6～1.452 0 μg(r=0.999 5)范圍內進樣量與峰面積呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為97.24%，97.76%，98.43%，96.89%，RSD(n=6)分別為0.78%，1.11%，0.93%，0.62%。結論 該方法簡便、準確、靈敏、重復性好，可作為瀉痢寧片中秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸的含量控制方法。

瀉痢寧片；秦皮甲素；秦皮乙素；黃芩苷；鞣花酸

瀉痢寧片為中藥復方制劑，處方來源于《衛生部藥品標準中藥成方制劑第十七冊》，由秦皮、黃芩、地錦草、地榆四味藥材組成。具有清熱燥濕、涼血解毒、止瀉止痢之功效，可用于大腸濕熱、血熱毒盛、瀉泄腹痛、下痢后重、腸炎菌痢見上述證候者的治療[1]。原部頒標準僅進行了性狀和薄層色譜鑒別控制，未對方中的任何藥物進行定量測定，不能有效保證產品的質量和療效。筆者在本實驗中采用高效液相梯度洗脫法對秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素和黃芩中黃芩苷，以及地錦草中鞣花酸進行含量測定方法研究，為完善該制劑質量標準提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀；G1322A脫氣機、G1329A自動進樣器、G1311A四元泵、Chemstation色譜工作站；G1315B可變波長檢測器。

1.2 試藥 秦皮甲素對照品(批號：110740-200104，純度：96.4%)、秦皮乙素對照品(批號：110741-200506，含量：98.1%)和黃芩苷對照品(批號：110715-201117，含量：91.7%)購于中國食品藥品檢定研究院；鞣花酸對照品(批號：476-66-4，含量：98.7%)購于上海同田生物技術股份有限公司；瀉痢寧片(規格：每片0.42 g，批號：131011，131016，131019)購于天津格斯寶藥業有限公司；磷酸(廣州化學試劑二廠，分析純，批號：120706)；甲醇 (天津市康科德科技有限公司，色譜純，批號：1315026) ；乙腈(安徽時聯特種溶劑股份有限公司，色譜純，批號：13025006)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為甲醇-乙腈(4：1)，流動相B為0.1%磷酸溶液，梯度洗脫(0～21 min，45.0%A；>21～31 min，45.0%→20.0%A；>31～45 min，20.0%A)；流速：1.1 mL·min-1；檢測波長(0～21 min，λ1=334 nm；>21～31 min，λ2=280 nm；>31～45 min，λ3=254 nm)。該系統條件下所測組分與其他組分分離效果良好，理論板數按秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸計均不得低于2 500，分離度均應> 2[2-10]。

2.2 樣品的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別取秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸對照品適量，精密稱定，加75%甲醇制成混合對照品溶液(秦皮甲素為0.058 6 mg·mL-1，秦皮乙素為0.015 4 mg·mL-1，黃芩苷為0.447 2 mg·mL-1，鞣花酸為0.072 6 mg·mL-1)。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取約 2.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(300 W，40 kHz)45 min，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照實驗 按瀉痢寧片處方比例稱取除秦皮的其余藥味、除黃芩的其余藥味和除地錦草的其余藥味各一份，按瀉痢寧片的生產工藝分別制成缺秦皮的陰性樣品、缺黃芩的陰性樣品和缺地錦草的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺秦皮的陰性對照溶液、缺黃芩的陰性對照溶液和缺地錦草的陰性對照溶液。分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液、缺秦皮的陰性對照溶液、缺黃芩的陰性對照溶液以及缺地錦草的陰性對照溶液各10 μL，按上述方法測定，結果在與秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸對照品色譜圖相應的保留時間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰，而陰性對照色譜圖中未顯示吸收峰(圖1)。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密量取混合對照品溶液0.5，2.5，5.0，7.5，10.0 mL置于10 mL量瓶中，用75%甲醇稀釋至刻度，即得系列標準溶液。按“2.1”項色譜條件每次進樣20 μL測定，以峰面積(Y)與進樣量(X)，得回歸方程為：秦皮甲素Y=2.254 7×106X+253.7，r=0.999 2；秦皮乙素Y=1.265 8×106X-398.2，r=0.999 8；黃芩苷Y=2.364 9×106X+823.8，r=0.999 6；鞣花酸Y=2.7935×106X-419.2，r=0.999 5。秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸分別在0.058 6～1.172 0，0.015 4～0.308 0，0.447 2～8.944 0，0.072 6～1.452 0 μg范圍內進樣量與峰面積線性關系良好。

2.3.2 精密度實驗 取“2.2.1”項混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件重復進樣6次，記錄秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸的峰面積，RSD分別為0.75%(秦皮甲素)、0.87%(秦皮乙素)、0.39%(黃芩苷)和0.66%(鞣花酸)。結果表明儀器具有良好精密度。

2.3.3 重復性實驗 稱取同一批樣品6份，按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法進樣測定，計算含量，求得素皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸RSD分別為0.87%，0.42%，0.89%和0.73%。結果表明本法測定重現性良好。

2.3.4 穩定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，在室溫下放置0，1，2，4，6，8 h后，每次進樣10 μL，測定其峰面積值，求得秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸RSD分別為0.69%、0.53%、0.36%和0.75%。結果表明供試品溶液8 h內基本穩定。

2.3.5 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批瀉痢寧片(秦皮甲素為1.462 mg·g-1，秦皮乙素為0.386 mg·g-1，黃芩苷為11.24 mg·g-1，鞣花酸為1.826 mg·g-1)10片，除去包衣，精密稱定，研細，取約 1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對照品溶液25 mL、用75%甲醇稀釋至刻度，按“2.2.2”項供試品溶液配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項色譜條件進樣測定，計算各組分回收率，結果見表1。

A.對照品；B.供試品；C.缺秦皮陰性對照品；D.缺黃芩陰性對照品；E.缺地錦草陰性對照品；1.秦皮甲素；2.秦皮乙素；3.黃芩苷；4.鞣花酸

圖1 5種溶液的HPLC色譜圖

A.reference substance；B.samples；C.negative control without fraxini cortex；D.negative control without scutellariae radix；E.negative control without euphorbiae humifusae herba；1.aesculin；2.aesculetin；3.baicalin；4.ellagic acid

Fig.1 HPLC chromatogram of five kinds of solutions

2.4 樣品測定 取3批樣品，按“2.2.2”項供試品制備方法，按“2.1”項色譜條件測定本品每片中秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸含量，結果見表2。

表2 每片樣品中4種成分含量測定結果

3 討論

取秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸對照品各適量，分別加75%甲醇溶解制成每毫升含0.04 mg的溶液，在波長200～400 nm處進行紫外掃描，結果秦皮甲素和秦皮乙素對照品溶液均在334.1 nm處有最大吸收，黃芩苷對照品溶液在280 nm處有最大吸收，鞣花酸對照品溶液在254 nm處有最大吸收。故選擇334 nm作為秦皮甲素和秦皮乙素的測定波長，280 nm作為黃芩苷的測定波長，254 nm作為鞣花酸的測定波長。

本實驗結果表明，所采用的方法簡便、準確、靈敏、重復性好，可作為瀉痢寧片中秦皮甲素、秦皮乙素、黃芩苷和鞣花酸的質量控制方法。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.027

Simultaneous Determination of Four Ingredients inXieliningTablets by HPLC

WEN Caihua

(DepartmentofPharmacy,theAffiliatedTumourHospital，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021,China)

Objective To develop a HPLC method for determination of aesculin， aesculetin，baicalin and ellagic acid inXieliningtablets. Methods The hypersil C18column was used with the flow rate of 1.1 mL·min-1.The mobile phase A consisted of methanol-acetonitrile(4：1)，the mobile phase B consisted of 0.1% phosphoric acid solution; The detection wavelengths wereλ1=334 nm(aesculin and aesculetin),λ2=280 nm(baicalin),andλ3=254 nm(ellagic acid). Results There was a good linear relationship between the peak area values and concentrations of aesculin，aesculetin，baicalin and ellagic acid.The quantitation range of aesculin，aesculetin，baicalin and ellagic acid was 0.058 6-1.172 0 μg(r=0.999 2), 0.015 4-0.308 0 μg(r=0.999 8),0.447 2-8.944 0 μg(r=0.999 6),and 0.072 6-1.452 0 μg(r=0.999 5), respectively.The average recovery was 97.24%(RSD=0.78%)，97.76%(RSD=1.11%)，98.43%(RSD=0.93%) and 96.89%(RSD=0.62%), respectively. Conclusion The method is convenient，accurate，sensitive，reproducible and may be used in the determination of aesculin， aesculetin，baicalin and ellagic acid inXieliningtablets.

Xieliningtablets; Aesculin; Aesculetin; Baicalin; Ellagic acid

2013-12-08

2014-01-20

文才華(1971-)，男，湖北孝感人，主管藥師，學士，主要從事醫院藥學和藥品質量控制工作。E-mail:wencaihualunwen@163.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)03-0384-04