三波長HPLC指紋圖譜和7組分測(cè)定評(píng)價(jià)銀黃片質(zhì)量

夏俊美，孫國祥

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 110016)

三波長HPLC指紋圖譜和7組分測(cè)定評(píng)價(jià)銀黃片質(zhì)量

夏俊美，孫國祥

(沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 110016)

目的 建立銀黃片三波長高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜和7組分測(cè)定評(píng)價(jià)方法，為全面評(píng)價(jià)不同廠家銀黃片質(zhì)量提供依據(jù)。方法 采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，Agilent Poroshell 120 SB C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)，0.2%磷酸溶液-甲醇為流動(dòng)相，線性梯度洗脫，流速為0.5 mL·min-1，柱溫(35.00±0.15) ℃，紫外檢測(cè)波長為214，278，326 nm，進(jìn)樣量5 μL，并用中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)4.0版軟件對(duì)13批銀黃片進(jìn)行質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)。以綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和野黃芩苷的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較5個(gè)不同廠家銀黃片的質(zhì)量差異。結(jié)果 以黃芩苷為參照物峰，分別確定28(214 nm)、29(278 nm)和26(326 nm)個(gè)共有指紋峰，建立了銀黃片高效液相色譜三波長指紋圖譜。系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)5個(gè)廠家的銀黃片化學(xué)指紋含量差異較大。結(jié)論 不同廠家生產(chǎn)的銀黃片質(zhì)量差異較大，有必要建立多波長和多指標(biāo)定量控制方法。該法為銀黃片質(zhì)量控制提供了新參考。

銀黃片；三波長指紋圖譜；7組分定量；系統(tǒng)指紋定量法；質(zhì)量控制

單味中藥或復(fù)方中藥均是多種化學(xué)物質(zhì)成分復(fù)雜體系。中藥指紋圖譜[1-2]作為多組分復(fù)雜樣品整體評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的有效控制方法，是目前能被國內(nèi)外廣泛接受的全面評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量模式[3]。筆者采用三波長色譜指紋圖譜和7組分測(cè)定法對(duì)銀黃片進(jìn)行質(zhì)量控制，使中藥復(fù)雜體系在三波長下形成的指紋圖譜盡可能實(shí)現(xiàn)每個(gè)化學(xué)指紋成分得到展現(xiàn)和控制，排除干擾從而強(qiáng)化指紋峰可辨識(shí)性，同時(shí)加大不同成分響應(yīng)差異，避免單波長指紋圖譜的片面性，使得非特征吸收的物質(zhì)信息也得到了較全面的表達(dá)，以展示中藥指紋圖譜豐富的多維信息特征。7組分測(cè)定控制中藥質(zhì)量彌補(bǔ)了單一指標(biāo)成分控制中藥質(zhì)量在表明中藥整體質(zhì)量信息及反映中藥有效性和安全狀況之處的不足，使得中藥質(zhì)量控制更加準(zhǔn)確，更能反映中藥質(zhì)量狀況，所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品組成更加清晰，產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性更加可靠。多波長色譜指紋圖譜+多指標(biāo)成分含量測(cè)定的控制模式[4-5]對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的定量控制，能保證中藥化學(xué)物質(zhì)均一性、有效性和穩(wěn)定性，并將成為中藥質(zhì)量控制的一種新型模式，具有重要的應(yīng)用前景。

銀黃片是《中藥部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》收載藥品[6]，由金銀花提取物和黃芩提取物制備而成，具有清熱、解毒、抗菌消炎作用。用于急慢性扁桃體炎和急慢性咽喉炎。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無含量測(cè)定項(xiàng)，文獻(xiàn)有測(cè)定銀黃膠囊[7-8]、銀黃口服液[9-10]、銀黃顆粒[11-12]中一種或兩種主要成分含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)不同廠家制劑進(jìn)行質(zhì)量差異比較。多波長色譜指紋圖譜與多指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)合對(duì)銀黃片質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，筆者未見文獻(xiàn)報(bào)道。筆者采用高效液相色譜法以綠原酸(chlorogenic acid，CGA)、咖啡酸(caffeic caid，CFA)、黃芩苷(baicalin，BCL)、漢黃芩苷(wogonoside，WG)、黃芩素(baicalein，BCE)、漢黃芩素(wogonin，WN)和野黃芩苷(scutellarin，SLN)的含量做為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較5個(gè)不同廠家銀黃片的質(zhì)量差異，結(jié)合3波長指紋圖譜整體控制其質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 型液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，低壓四元梯度泵，在線脫氣和自動(dòng)進(jìn)樣裝置)，Chemstation工作站(Agilent科技有限公司)。KDM 型控溫電熱套(山東鄄城華魯儀器公司)，RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，Sarturius-BS110S分析天平(北京賽多利斯天平有限公司，萬分之一天平)，KS-120D超聲波清洗器(寧波科生儀器廠)。

1.2 試藥 CGA(批號(hào)：110753-200413)、CFA(批號(hào)：885-200001)、BCL(批號(hào)：110715-200212)、WN(批號(hào)：111514-200403)、SLN(批號(hào)：110842-200403)對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用。BCE(批號(hào)：110705)、WG(批號(hào)：110802)對(duì)照品購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。甲醇(購自山東禹王實(shí)業(yè)總公司)、磷酸(購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)均為色譜純，供含量測(cè)定用。所用水為去離子水。

13批銀黃片均為市售品，標(biāo)號(hào)S1～S13，其中S1～S5、S6～S8、S9～S10、S11～S12和S13分別由不同廠家生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為0.4 mg·mL-1CGA，0.4 mg·mL-1CFA，1.9 mg·mL-1BCL，0.9 mg·mL-1BCE，1.8 mg·mL-1WG，2.3 mg·mL-1WN，1.0 mg·mL-1SLN的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試液的制備 取銀黃片2片，精密稱定，除去薄膜衣并研碎，取約0.48 g，精密稱定，加甲醇20 mL，回流提取1 h，過濾，殘?jiān)蛹状?0 mL回流提取0.5 h，將所得濾液與前兩次濾液合并，減壓濃縮至6 mL，用甲醇定容至10 mL，搖勻，作為貯備液。將貯備液稀釋為原濃度1/5作供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB C18柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)。流動(dòng)相：A為0.2%磷酸溶液；B為甲醇。梯度程序： 0～7 min，7% B；7～10 min，7%→10%B；10～15 min，10%→15%B；15～20 min，15%→16%B；20～35 min，16%→31%B；35～45 min，31%→46%B；45～55 min，46%→55%B；55～70 min，55%→80%B；70～90 min，80%→100%B。流速為0.5 mL·min-1，柱溫為(35.00±0.15) ℃，紫外檢測(cè)波長分別為214，278，326 nm，進(jìn)樣5 μL，洗脫95 min。

2.4 指紋圖譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)以色譜指紋圖譜指數(shù)(index of chromatographic fingerprints，F(xiàn))作為優(yōu)化目標(biāo)函數(shù)，見(1)式。F反映指紋信號(hào)大小和信號(hào)均化程度(γ)及分離效率(β)高低，F(xiàn)值越大越好[13]。

實(shí)驗(yàn)分別以水(Water)、25%乙醇(EtOH)(V/V)、50%EtOH、75%EtOH、95%EtOH和甲醇(MeOH)為提取溶劑考察提取效率，采用洗脫程序有：A為0.2%磷酸溶液，B為甲醇。GEP1：0～7 min，7%B；7～10 min，7%→10%B；10～15 min，10%→15%B；15～20 min，15%→16%B；20～35 min，16%→31%B；35～45 min，31%→46%B；45～55 min，46%→55%B；55～70 min，55%→80%B；70～90 min，80%→100%B。GEP2：0～7 min，7%B；7～10 min，7%→10%B；10～15 min，10%→15%B；15～20 min，15%→16%B；20～35 min，16%→20%B；35～45 min，20%→22%B；45～60 min，22%→35%B；60～70 min，35%→48%B；70～80 min，48%→65%B；80～90 min，65%→85%B。考察了兩種色譜柱，分別為Venusil XBP C18柱(Column 2)和Agilent Poroshell 120 SB C18色譜柱(Column 1)。記錄278 nm及190～400 nm DAD譜圖。計(jì)算并比較各條件下F，見圖1。根據(jù)F大小最終確定以MeOH為提取溶劑，選擇洗脫程序GEP1和用Agilent Poroshell 120 SB C18色譜柱。

2.5 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取S6供試品溶液、CGA、CFA、BLN、BCE、WG、WN和SCL對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣5 μL，記錄3波長下的色譜圖(圖2)。比較保留時(shí)間及在線紫外光譜可知，214 nm檢測(cè)的4，6，12，17，22，24和25號(hào)峰；對(duì)應(yīng)278 nm檢測(cè)的4，5，11，17，21，24和26號(hào)峰；對(duì)應(yīng)326 nm檢測(cè)的3，5，13，17，21，24和25號(hào)峰，分別為CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN。因黃芩苷峰響應(yīng)值較大且與相鄰峰分離較好，故選作參照物峰。考察此檢測(cè)條件的2 h空針圖中未見溶劑峰，2 h供試液色譜圖中組分在95 min內(nèi)出峰完全，確定洗脫95 min。

圖1 銀黃片HPLC指紋圖譜在不同條件下F值

Fig.1 TheFvaluaes under different condition forYinghuangtablets HPLC fingerprints

圖2 銀黃片在214，278和326 nm的色譜圖和CGA、CFA、BCL、WG、BCE、WN及SLN混合對(duì)照品HPLC圖

Fig.2 HPLC chromatograms of Yinhuang tablets and mixed control of CGA，CFA，BCL，WG，BCE，WN and SLN at 214，278，326 nm

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取S1供試液5 μL連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。以BCL峰保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算3波長下各共有峰相對(duì)保留時(shí)間，RSD均<1.3%。各波長下各共有峰峰面積的RSD：214 nm時(shí)除1號(hào)和16號(hào)峰外，其余均<1.0%；278 nm時(shí)除7號(hào)、25號(hào)和29號(hào)峰外，其余各峰相對(duì)峰面積RSD均<2.5%；326 nm時(shí)除1號(hào)和23號(hào)峰外，其余RSD均<2.0%，表明進(jìn)樣精密度符合要求。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別在制備S1供試液后0，7，12，18，24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以BCL峰保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算3波長下各共有峰相對(duì)保留時(shí)間，RSD均<2.0%。各波長下各共有峰峰面積的RSD：214 nm時(shí)除1號(hào)和8號(hào)峰外，其余均<1.0%；278 nm時(shí)除7，25和29號(hào)峰外，其余各峰相對(duì)峰面積RSD均<3.1%；326 nm時(shí)除1，16和23號(hào)峰外，其余RSD均<2.0%。表明樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S1樣品平行制備5份供試液，分別吸取5 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以BCL峰保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算3波長下各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<1.8%。各波長下各共有峰峰面積的RSD：214 nm時(shí)除1號(hào)和8號(hào)峰(1.5%)外，其余均<1.0%；278 nm時(shí)除7，25和29號(hào)峰外，其余各峰相對(duì)峰面積RSD均<3.7%；326 nm時(shí)除1，12，16和23號(hào)峰外，其余RSD均<2.0%。表明方法重復(fù)性良好。

2.9 線性關(guān)系考察 精密吸取此溶液5，2，1，0.5，0.1，0.02 mL分別置于10 mL量瓶，用甲醇定容，搖勻即得，按“1.4”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表1。 結(jié)果表明CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 7組分含量測(cè)定線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

Tab.1 Equation of linear regression, linearity range and correlation coefficient of content determination on seven constituents

化合物回歸方程r線性范圍/(μg·mL-1)CGAY=10．891X+4．53280．99993．8～1900CFAY=23．687X+5．56290．99991．8～900SLNY=22．965X-1．72210．99993．6～1823．5BCLY=30．481X+26．9920．99984．6～2300WGY=37．972X+21．0330．99982．0～1000BCEY=56．129X+0．33520．99990．8～400WNY=64．134X+22．6050．99980．8～400

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的S1樣品 6份，每份約0.5 g，分別準(zhǔn)確加入CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN對(duì)照品適量，按“2.2”項(xiàng)方法制備各供試品溶液并在“2.3”項(xiàng)條件下測(cè)定。CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN平均回收率分別為97.2%，100.5%，95.9%，101.3%，99.1%，98.9%和99.0%，其RSD分別為1.8%，1.9%，2.1%，1.2%，1.6%，1.8%和2.0%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.11 銀黃片三波長指紋圖譜建立與評(píng)價(jià) 考慮CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN各物質(zhì)的最大吸光度，故選取3個(gè)檢測(cè)波長214，278和326 nm。將13批銀黃片供試液分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖(圖3)。以黃芩苷峰為參照物峰，按峰出現(xiàn)率80%計(jì)，確定各檢測(cè)波長下的共有指紋峰為：28(214 nm)，29(278 nm)和26(326 nm)。將13批樣品的積分AIA信號(hào)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)4.0軟件[14]，按均值法計(jì)算生成準(zhǔn)對(duì)照指紋圖譜并計(jì)算13批樣品的宏定性相似度(macro qualitative similarity，Sm)、宏定量相似度(macro quantitative similarity，Pm)和指紋均化變動(dòng)系數(shù)(relative deviation of leveling coefficient，α)，并以Sm、Pm和α為指標(biāo)，用SPSS19.0版軟件對(duì)13批樣品進(jìn)行聚類分析。結(jié)果S6-S9和S13為第Ⅰ類，S1-S5、S10-S12為第Ⅱ類，選第I類5批樣品指紋譜，按均值法重新生成三波長下對(duì)照指紋圖譜(referential fingerprint，RFP)，見圖3。

采用系統(tǒng)指紋定量法對(duì)銀黃片復(fù)雜物質(zhì)組分系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，用Sm整體鑒定樣品化學(xué)指紋數(shù)量和含量分布比例與RFP差別，用Pm測(cè)定銀黃片化學(xué)指紋整體含量與RFP的差異，用指紋變異系數(shù)α判定樣品指紋與RFP指紋的同態(tài)性，見(2-4)式。13批樣品的Sm、Pm、α及質(zhì)量等級(jí)見表2，按SQFM鑒別出S6-S9及S13質(zhì)量等級(jí)都在3級(jí)(Good，好)以上，除326 nm下S13質(zhì)量等級(jí)為6級(jí)(Common，一般)外，其余質(zhì)量均為劣。這主要是由于各批次Pm值過大或過小而引起的，表明銀黃片中藥效物質(zhì)含量差異較大。

2.12 樣品測(cè)定 分別精密吸取供試品5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。將所得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CGA、CFA、SLN、BCL、WG、BCE和WN 含量，結(jié)果見表2。結(jié)果表明不同廠家及同一廠家不同批次樣品中各物質(zhì)含量有顯著差異(圖4)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過三波長色譜指紋圖譜和7組分測(cè)定的控制模式，采用系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià)銀黃片質(zhì)量并建立了快速測(cè)定不同廠家銀黃片中CGA、CFA、BCL、WG、BCE、WN和SLN7種成分含量的分析方法。結(jié)果表明方法簡單，快速，準(zhǔn)確，為本制劑的質(zhì)量控制提供了新參考。不同廠家、不同批號(hào)的制劑中各物質(zhì)含量相差甚大，而各廠家藥品服用量卻是相同的，這是臨床用藥療效差異的主要原因之一，建議統(tǒng)一該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

A.214 nm；B.278 nm；C.326 nm

濾長參數(shù)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13214nmSm0．790．880．890．850．870．980．980．980．980．810．700．650．86Pm11．713．715．915．615．6106．397．0106．8107．848．519．02．681．2α0．700．530．500．540．380．020．010．020．020．490．470．990．02等級(jí)8888821228883質(zhì)量劣劣劣劣劣較好最好較好較好劣劣劣好278nmSm0．780．760．820．800．860．980．980．980．970．930．820．710．86Pm10．613．115．114．715．1106．395．3105．6107．245．718．72．384．3α0．620．540．500．520．390．040．010．000．030．460．530．850．06等級(jí)8888821228883質(zhì)量劣劣劣劣劣較好最好較好較好劣劣劣好326nmSm0．790．830．830．840．850．970．980．980．970．860．740．750．83Pm11．713．315．714．714．0112．199．2111．4111．853．416．82．363．2α0．330．300．300．300．220．020．030．040．010．370．300．400．22等級(jí)8888831337886質(zhì)量劣劣劣劣劣好較好好好缺陷劣劣一般含量CGA2．1551．9052．3231．9671．2989．0258．22410．1488．8079．2261．6010．4640．198(mg·g-1)CFA0．1090．0920．1020．0900．0621．2991．0511．1401．1441．1630．0310．0320．082SLN0．0770．0880．0960．0960．0980．1930．3090．2980．0980．0310．0440．0120．263BCL1．2691．6261．9271．8522．02716．77514．15016．10717．7456．0322．9470．28213．589WG0．2200．3200．3610．3450．3790．2290．1160．1410．4060．6610．4710．0822．560BCE0．2000．2790．3190．3460．3340．5680．9201．1150．9850．9561．1130．0250．943WN0．0480．0800．0840．0970．0770．0890．1100．1400．0930．1210．2930．0170．310

圖4 13批銀黃片樣品中7組分含量曲線圖

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.024

Quality Evaluation ofYinhuangTablets via Digitized and Quantified Fingerprints by High Performance Liquid Chromatography and Seven Components Detection

XIA Junmei， SUN Guoxiang

(CollegeofPharmacy，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China)

Objective To establish the quality control ofYinhuangtablet (YHT) by using sever ingredients determination and tri-wavelength fingerprint analysis technologies. Methods The chromatographic fingerprints were developed by using Agilent Poroshell 120 SB C18(4.6 mm×150 mm， 2.7 μm) as the separation column and 0.2% H3PO4-methanol as the mobile phase.The flow rate was 0.5 mL·min-1， the UV absorbance was monitored at 214， 278 and 326 nm by injecting 5 μL of the sample solution and the column temperature was maintained at (35.00±0.15) ℃.The chromatographic fingerprints were characteristically evaluated for quality ranking of 13 batches of YHT by the 4.0 software of the digitized evaluation system of traditional chinese medicine fingerprint with the super information characteristics.Seven marker compounds including chlorogenic acid， caffeic acid， baicalin， wogonoside， baicalein， wogonin and scutellarin were simultaneously determined to compare the variation among five different manufacturers. Results The tri-wavelength fingerprint high performance liquid chromatography method was established.A total of 28(214 nm),29(278 nm)and 26(326 nm)common peaks were identified at respective wavelengths, using baicalin (BCL) as the referential peak.The software was applied to evaluate the YHT-HPLC fingerprints and identify the quality of 13 batches of YHT by systematically quantified fingerprint method (SQFM).The results showed that the content from the different manufacturers varied greatly. Conclusion The quality of YHT varies between different makers, and is necessary to establish the criterion for quality control.This method can provide a new reference for the quality control of YHT.

Yinhuangtablet; Tri-wavelength fingerprint; Seven ingredients quantification; Systematically quantified fingerprint method；Quality control

2014-01-07

2014-02-10

夏俊美(1986-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，在讀碩士，研究方向：中藥指紋圖譜研究。E-mail：xiajunmei1@163.com。

孫國祥(1962-)，男，遼寧凌源人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥指紋學(xué)體系及其信息學(xué)研究。電話：024-23986286，E-mail：gxswmwys@163.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)03-0371-06