IGFBP-3在白藜蘆醇抑制胃癌細胞增殖過程中的作用

孫海斌，何曉燕，馬梅

(鄭州大學第五附屬醫院病理科，鄭州 450000)

IGFBP-3在白藜蘆醇抑制胃癌細胞增殖過程中的作用

孫海斌，何曉燕，馬梅

(鄭州大學第五附屬醫院病理科，鄭州 450000)

目的 研究在白藜蘆醇(Res)抑制胃癌細胞增殖過程中，胰島素樣生長因子結合蛋白-3(IGFBP-3)表達的變化。方法 噻唑藍(MTT)法測定Res對BGC-823細胞增殖的抑制程度，實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)和Western blot技術檢測Res處理后BGC-823細胞中IGFBP-3表達變化，siRNA技術沉默IGFBP-3基因表達，MTT法觀察Res對BGC-823細胞增殖的影響，流式細胞技術測定各組細胞凋亡率。結果 Res能夠抑制BGC-823生長，經20，40，80，160 μmol·L-1Res處理后，細胞存活率分別為(82.35±10.65)%，(74.30±12.36)%，(62.80±14.66)%，(50.75±11.14)%。Res刺激后，IGFBP-3表達水平升高，與對照組比較，IGFBP-3 mRNA水平增高2.96 倍(P<0.05)， IGFBP-3蛋白水平變化與其mRNA一致。siRNA技術沉默IGFBP-3表達后，160 μmol·L-1Res刺激BGC-823細胞，細胞存活率下降(78.5±9.86)%，但高于同濃度下Res刺激的未經IGFBP-3沉默的BGC-823細胞(P<0.05)。IGFBP-3沉默后，160 μmol·L-1Res處理后BGC-823細胞凋亡率(20.13±9.12)%，明顯低于未經IGFBP-3沉默的BGC-823細胞[(35.48±11.12)%]，且差異有統計學意義(P<0.05)。結論 Res可以抑制BGC-823細胞增殖，促進其凋亡。該機制涉及IGFBP-3高表達。

白藜蘆醇；胰島素樣生長因子結合蛋白-3；BGC-823細胞

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，具有容易轉移、預后較差的特點。目前胃癌的治療方式主要包括手術、化學治療(化療)、放射治療、靶向治療[1]。但前3種治療方式對機體損傷較大，因此，高效、具有選擇性、對機體損傷小的靶向治療倍受關注。在此背景下，針對特定信號通路或者轉錄因子且可以誘導腫瘤細胞凋亡的藥物越來越受重視[2]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從植物白藜蘆的根中提取的酚類物質，也存在于葡萄等植物中，具有保護神經、保護血管、抗氧化、抗炎、抗癌等功能[3-4]。研究表明，Res可以抑制胃癌細胞、胰腺癌細胞、鼻咽癌細胞增殖[5-7]，但其抑制細胞增殖的具體機制尚不明確。胰島素樣生長因子結合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3)是胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)特異性結合蛋白，具有調節細胞增殖的作用。既往研究表明，IGFBP-3可以促進細胞凋亡[8]，但IGFBP-3與胃癌細胞凋亡關系的報道筆者較少見到。筆者在本研究中假設Res抑制胃癌細胞BGC-823增殖的機制與IGFBP-3有關，探討Res處理后BGC-823細胞中IGFBP-3表達水平的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Res(Sigma公司，批號：R5010，純度>99%)，BGC-823細胞株(購自中國科學院上海生命科學研究所，批號：TCHu 45)。RPMI-1640培養液(賽默飛世爾生物化學制品有限公司，批號：31800022)，胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司，批號：sc-224480)，噻唑藍(methyl thiazoly tetrazolium，MTT)試劑(Sigma公司，批號：M2128)，RNAiso Plus Kit[寶生物工程(大連)有限公司，批號：D9108A]，PrimeScript?RTreagent Kit(寶生物工程有限公司，批號：RR037Q)，凋亡檢測試劑盒(Sigma公司，批號：APOAF-20TST)，SYBR?Premix EX TaqⅡ(寶生物工程有限公司，批號：RR420L)，Dy-Light 800 紅外二抗(KPL實驗技術公司，批號：AA0454)，放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液(北京普利萊生物技術公司，批號：C1053)，雙喹啉-4-羧酸二鈉鹽(bicin choninic acid,BCA)蛋白定量分析盒(北京普利萊生物技術公司，批號：P1511)，小鼠抗人IGFBP-3多克隆抗體(santa cruz公司，批號：sc-374365)，小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氨酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體(santa cruz公司，批號：sc-365062)，siRNA序列(上海英為信生物科技有限公司，批號：RY-42569)，LipofectamineTM 2000轉染試劑(美國Invitrogen公司，批號：11668-019)。WD-2102A酶標儀(北京六一儀器廠)。乙二胺四乙酸二鈉(Sigma公司，批號：E6758)；胰酶(Sigma公司，批號：P7545)。

1.2 細胞的培養 BGC-823細胞培養采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，培養于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)環境。采用含0.02%乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的0.25%胰酶消化細胞并傳代，選取生長良好的對數期細胞進行實驗。

1.3 MTT實驗檢測Res對BGC-823細胞的抑制作用 選取生長狀態良好的對數期細胞制成細胞懸液，并接種于96孔板，細胞密度1.0×105·mL-1，每孔懸液量100 μL。常規培養，待細胞貼壁后分為5組，其中一組為對照組，不做任何處理。其余4組分別暴露于20，40，80，160 μmol·L-1Res中。每組設5個平行孔，同時設調零孔。常規培養24 h后，每孔加入MTT試劑10 μL，繼續培養4 h。棄去各孔中原有液體，加入二甲基亞砜(dimethyl-sulforide,DMSO)100 μL，置于搖床15 min，使其充分溶解。使用WD-2102A酶標儀測定各孔在490 nm處的吸光度(A值)。計算細胞存活率：細胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。實驗重復3次。

1.4 實時熒光定量PCR 檢測Res處理后BGC-823的IGFBP-3 mRNA表達水平 收集對數期細胞，制備細胞懸液，以1.0×105·mL-1密度接種于6孔板，每孔2.0 mL。細胞貼壁后分為5組：對照組和20，40，80，160 μmol·L-1Res處理組。繼續培養24 h。使用RNA iso裂解試劑提取細胞總RNA。使用PrimeScript RT 試劑盒對提取出的RNA進行反轉錄，獲取cDNA模板。反轉錄體系參照試劑盒說明書。使用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒對上述合成的cDNA進行PCR擴增，引物序列見表1。反應體系和方案參照試劑盒說明書。選擇GAPDH作為內參。使用PCR儀自帶軟件查看并分析反應結果，使用2-△△Ct法處理數據，獲取各組IGFBP-3的mRNA相對表達情況。

表1 IGFBP-3與內參β-actin引物序列

Tab.1 Primer sequence of IGFBP-3 and β-actin

引物引物序列(5′?3′)IGFBP?3ForwardprimerCAGCCAGCGCGCTACAAGTTGACTAIGFBP?3ReverseprimerCTGGGACTCAGCACATTGAGGAGAPDHForwardprimerTGGCACCCAGCACAATGAAGAPDHReverseprimerCTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA

1.5 Western blot檢測Res處理后BGC-823的IGFBP-3 蛋白表達水平 收集對數期細胞，并制備細胞懸液，以1.0×105·mL-1密度接種于6孔板，每孔2.0 mL。細胞貼壁后，將其分為5組：對照組，20，40，80，160 μmol·L-1Res處理組。繼續培養24 h。使用含有1%蛋白酶抑制劑混合物的RIPA蛋白裂解液(每孔500 μL)裂解細胞提取總蛋白。將總蛋白樣本與上樣緩沖液混勻，煮沸3 min后上樣，每孔上樣量20 μg。使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓100 V，時間1.5 h。隨后轉膜，使用醋酸纖維素(nitrocellulose,NC膜)，轉膜條件為恒流200 mA，時間1.0 h。轉膜完成后，使用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別使用小鼠抗人IGFBP-3抗體(1：500)與小鼠抗人GAPDH抗體(1：1 000)4 ℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffed solution,PBS)洗滌3次，除去未結合的一抗。Dy-Light 800紅外標記的二抗避光孵育膜2 h，PBS洗滌3次，除去多余二抗，遠紅外成像系統分析蛋白條帶。

1.6 使用siRNA進行IGFBP-3的表達沉默及其對Res抑制效能的影響 以每孔1×104個的密度將細胞接種于無抗生素的培養基中，96孔板中常規培養24 h。使用無血清RPMI-1640培養液分別稀釋siRNA(終濃度100 nmol·L-1)與LipofectamineTM 2000轉染試劑(1：50)，并將稀釋后的siRNA與稀釋后的轉染試劑混合(總體積100 μL)，將此混合液充分振蕩后室溫靜置20 min，每孔加入上述混合液100 μL。同時按此法設立無關序列的siRNA陰性對照組。加入含10%血清的PRMI-1640培養液100 μL，混合均勻繼續培養48 h，炎癥IGFBP-3在mRNA水平與蛋白水平的沉默效果。獲取良好沉默效果的細胞，照“1.3”項下方法進行MTT實驗，分為不做任何處理的對照組、160 μmol·L-1Res處理的普通BGC-823細胞組(Res組)、160 μmol·L-1Res處理的IGFBP-3沉默的BGC-823細胞組(siRNA+Res組)。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 分組同“1.6”項MTT分析，即將細胞分為對照組、Res組、siRNA組、siRNA +Res組，培養24 h后，收集細胞，使用預冷冰PBS洗滌細胞，離心后使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒中的緩沖液500 μL 重懸浮細胞。依次加入Annexin V 5 μL及PI 10 μL，常溫避光靜置10 min后，使用流式細胞儀分析獲取散點圖，計數右上象限和右下象限的百分比之和作為總凋亡率，實驗重復3次。

1.8 統計學方法 使用SPSS18.0版統計軟件進行統計學分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Res抑制BGC-823細胞增殖 見圖1。MTT分析顯示，Res可以抑制BGC-823細胞增殖，且抑制程度呈濃度依賴關系。40，80，160 μmol·L-1Res處理組細胞存活率分別為(74.30±12.36)%，(62.80±14.66)%，(50.75±11.14)%，與對照組[82.35±10.65)%]比較，均差異有統計學意義(均P<0.05)。

2.2 Res導致BGC-823細胞IGFBP-3表達水平增高 與對照組比較，20，40，80，160 μmol·L-1Res處理組細胞IGFBP-3 mRNA水平分別提高(1.35±0.03)，(1.86±0.05)，(2.11±0.07)，(2.96±0.08)倍，均差異有統計學意義(均P<0.05)。20，40，80，160 μmol·L-1Res處理組BGC-823細胞IGFBP-3蛋白水平升高，條帶灰度值與對照組比較，均差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2，3。

2.3 IGFBP-3沉默緩解了Res對BGC-823細胞的增殖抑制 siRNA技術沉默IGFBP-3表達后，以160 μmol·L-1Res刺激BGC-823細胞，細胞存活率下降為(78.51±9.86)%，高于160 μmol·L-1Res刺激的未經IGFBP-3沉默的BGC-823細胞[(58.32±13.63)%]，兩組比較，差異有統計學意義(t=2.861，P<0.05)。siRNA處理不影響細胞生存率[(92.54±14.33)%]。見圖4。

2.4 IGFBP-3沉默對Res誘導的細胞凋亡的影響 AnnexinV-FITC/PI雙染結合流式細胞技術分析發現，Res可誘導BGC-823細胞凋亡。對照組細胞凋亡率(7.44±2.01)%，Res處理后，細胞凋亡率(35.48±11.12)%，siRNA處理組細胞凋亡率(20.13±9.12)%，siRNA處理組與Res處理組比較，差異有統計學意義(t=2.913，P<0.05)。表明IGFBP-3沉默可以減輕Res所致BGC-823細胞凋亡。見圖5。

A.對照組；B.20 μmol·L-1Res組；C.40 μmol·L-1Res組；D.80 μmol·L-1Res組；E.160 μmol·L-1Res組；與對照組比較，*1P<0.05

圖1 5組細胞存活率測定結果

A.control； B.20 μmol·L-1Res group；C.40 μmol·L-1Res group；D.80 μmol·L-1Res group；E.160 μmol·L-1Res group；Compared with control，*1P<0.05

Fig.1 Survival rate of five groups of cells

A.對照組；B.20 μmol·L-1Res組；C.40 μmol·L-1Res組；D.80 μmol·L-1Res組；E.160 μmol·L-1Res組；與對照組比較，*1P<0.05

圖2 5組細胞IGFBP-3 mRNA水平測定結果

A.control group；B.20 μmol·L-1Res group；C.40 μmol·L-1Res group；D.80 μmol·L-1Res group；E.160 μmol·L-1Res group；Compared with control，*1P<0.05

Fig.2 Relative expression of IGFBP-3 mRNA in five groups of cells

A.對照組；B.20 μmol·L-1Res組；C.40 μmol·L-1Res組；D.80 μmol·L-1Res組；E.160 μmol·L-1Res組

圖3 5組細胞IGFBP-3 蛋白表達變化

A.control group；B.20 μmol·L-1Res group；C.40 μmol·L-1Res group；D.80 μmol·L-1Res group；E.160 μmol·L-1Res group

Fig.3 Expression of IGFBP-3 protein in five groups of cells

3 討論

Res廣泛存在于植物中，毒性較低，有良好的應用前景。大量研究認為，Res抑制腫瘤細胞增殖的機制是誘導細胞凋亡，該過程中存在Caspase-3激活。Caspase處于細胞凋亡信號轉導通路的核心位置，激活Caspase-3通過級聯反應干擾細胞信號轉導，DNA修復等功能從而誘發凋亡[9-10]。Res還可通過Fas/FasL途徑誘導細胞凋亡，機制還涉及其他多個凋亡調控因子[11]。但目前研究結果還不足以完全解釋Res發揮凋亡作用的機制，如Res是如何激活上述因子的機制還未得到證實。筆者在研究中假設IGFBP-3扮演了Res激活凋亡因子的中間角色，即Res首先提高IGFBP-3的表達水平，通過IGFBP-3再與其他凋亡因子發生作用。本研究發現Res處理細胞后，IGFBP-3的表達增高，這在一定程度上與之前假設一致。IGFBP-3是胰島素樣生長因子結合蛋白家族的重要成員，可從以下兩個途徑引起細胞增殖抑制：首先 IGFBP-3可以與IGF-1特異性結合，從而減少游離的有活性的IGF-1水平，細胞由于缺少IGF-1活性，生長受限[12]。其次，IGFBP-3可以通過其他一些凋亡調控因子發揮凋亡作用。例如，IGFBP-3可以影響MAPK通路，MAPKs 家族的成員主要有JNK、ERK、以及P38。這些成員發生磷酸化激活后，可進一步激活相關轉錄因子，對凋亡產生促進作用[13]。除此之外，IGFBP-3可以加強TGF-β1誘導的p38的活化，從而增加細胞凋亡，Bcl-2家族、Bad、Bax、NF-κB等凋亡調控因子與IGFBP-3的關系也有報道。既往研究表明，Res促進凋亡的過程除了與Caspase家族有關外，也與MAPKs通路、Bcl-2家族、Bad、Bax、NF-κB等因子相關[14]。因此，不難假設Res的抗凋亡作用與IGFBP-3有一定的聯系。本研究發現，在Res誘導胃癌細胞凋亡的過程中，細胞內的IGFBP-3表達有所增多，提示Res可能通過IGFBP-3參與了對凋亡的促進。通過siRNA技術沉默IGFBP-3后，Res的增殖抑制作用不明顯，這進一步證實了IGFBP-3在此過程中的作用。但Res如何提高IGFBP-3表達，IGFBP-3提高后導致哪些下游哪些通路的活化或抑制，目前還無法解釋，需在后續研究中探索。總之，本研究發現Res能夠抑制胃癌BGC823細胞的增殖，并且該過程伴有IGFBP-3表達增多，IGFBP-3可能在Res抑制腫瘤細胞增殖的過程中發揮一定作用。

A.對照組；B.160 μmol·L-1Res處理的普通BGC-823細胞組(Res組)；C.未經res處理的IGFBP-3沉默BGC-823細胞組(siRNA)；D.160 μmol·L-1Res處理的IGFBP-3沉默BGC-823細胞組(Res+siRNA組)；與對照組比較，*1P<0.05；與20 μmol·L-1Res組比較，*2P<0.05

圖4 IGFBP-3基因沉默后4組細胞存活率

A.control；B.160 μmol·L-1Res treated non-transfected BGC-823 cells(Res group)；C.IGFBP-3 silence BGC-823 cells(siRNA)；D.160 μmol·L-1Res treated IGFBP-3 silence BGC-823 cells(Res+siRNA)；Compared with control，*1P<0.05；compared with Res group 20 μmol·L-1，*2P<0.05

Fig.4 Survival rate of five groups of cells after IGFBP-3 knockdown

A.對照組；B.160 μmol·L-1Res處理的普通BGC-823細胞組(Res組)；C.160 μmol·L-1Res處理的IGFBP-3沉默BGC-823細胞組(Res+siRNA組)；D.未經res處理的IGFBP-3沉默BGC-823細胞組(siRNA)；與對照組比較，*1P<0.05；與20 μmol·L-1Res組比較，*2P<0.05

圖5 IGFBP-3基因沉默后4組細胞凋亡率

A.control；B.160 μmol·L-1Res treated non-transfected BGC-823 cells(Res group)；C.160 μmol·L-1Res treated IGFBP-3 silence BGC-823 cells(Res+siRNA)； D.IGFBP-3 silence BGC-823 cells(siRNA)；Compared with control，*1P<0.05；compared with Res group 20 μmol·L-1，*2P<0.05

Fig.5 Apoptosis rate of four groups of cells after IGFBP-3 knockdown

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.009

Effect of IGFBP-3 in the Inhibition of Gastric Carcinoma Cells Proliferation by Resveratrol

SUN Haibin， HE Xiaoyan，MA Mei

(DepartmentofPathology，theFifthAffiliatedHospitaltoZhengzhouUniversity，Zhengzhou450000，China)

Objective To study the expression of insulin like growth factor binding proteins 3 (IGFBP-3) during inhibition of resveratrol (Res) on cell proliferation. Methods The inhibitory effect of Res on BGC-823 cells was determined by MTT method; Real-time qRT-PCR and western blot were applied to detect the expression of IGFBP-3 in Res-treated BGC-823 cells.In addition, cytometry was used to determine the proliferation and apoptosis of Res-treated BGC-823 after knockdown of IGFBP-3 by siRNA. Results Upon Res (20，40， 80 and 160 μmol·L-1) treatment，the viability of BGC-823 cells was (82.35±10.65)%，(74.30±12.36)%，(62.80±14.66)% and (50.75±11.14)%， respectively.The mRNA and protein expression of IGFBP-3 elevated as high as 2.96-fold compared to the control group (P<0.05).The cell viability of BGC-823 cells with IGFBP-3 knockdown was significantly higher than that of the wild type (P<0.05) only at high Res concentration (160 μmol·L-1).Meanwhile，IGFBP-3 knockdown led to a significant decrease on cell apoptotic rate by Res (160 μmol·L-1) [(20.13±9.12)% vs (35.48±11.12)%，P<0.05)]. Conclusion Res can inhibit BGC-823 cell proliferation and promote cell apoptosis, the underlying mechanism of which may be related to the overexpression of IGFBP-3 in BGC-823 cells.

Resveratrol; insulin like growth factor binding proteins 3 (IGFBP-3); BGC-823 cell

2014-01-08

2014-02-10

孫海斌(1963-)，男，河南鄭州人，副主任醫師，學士，主要研究方向：腫瘤病理。E-mail：sunhb5h@163.com。

何曉燕(1985-)，女，河南鄭州人，主治醫師，碩士，主要研究方向：腫瘤病理。E-mail：he_xiaoyan2010@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)03-0317-05