寧波副溶血性弧菌臨床株毒力基因與多位點序列分型研究

高 紅，宋啟發，徐景野，鄭 劍，沈玄藝

寧波副溶血性弧菌臨床株毒力基因與多位點序列分型研究

高 紅，宋啟發，徐景野，鄭 劍，沈玄藝

目的 了解寧波地區副溶血性弧菌臨床分離株毒力基因分布以及分子分型特征。方法 收集來源于食物中毒和散發腹瀉患者副溶血弧菌菌株，利用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測耐熱直接溶血素基因(tdh)和耐熱直接溶血素相關溶血素基因(trh)，利用多位點序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)進行分子分型。結果 2006—2012年共分離臨床株248株，選擇48株進行毒力基因和MLST分型研究。42株tdh+，為93.75%；11株trh+，為22.92%。48株菌株可分為9個ST型和一個未分型，ST3有32株，占66.67%； ST265有5株，占10.42%；ST120有3株，占6.25%。ST3克隆群中tdh+/trh-菌株有25株，占78.16%。與全國其他地區比較，在寧波臨床株中發現ST262。結論 tdh+型是寧波地區副溶血性弧菌優勢菌株。有9種ST型，以ST3克隆為主，其次為ST265和ST120。ST3克隆中以tdh+/trh-型為主。另發現1個獨特的ST262菌株。

副溶血性弧菌；耐熱直接溶血素基因；耐熱直接溶血素相關溶血素基因；多位點序列分型

Funded by the Ningbo Municipal Science & Technology Bureau (Nos.2012B82018 and 2011C50041)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，VP) 是革蘭氏陰性嗜鹽細菌，屬于弧菌科弧菌屬，廣泛存在于近海岸的海水、海水沉積物和魚蝦、貝類等海產品中及食品加工環境中[1]。1994—2005年在中國的細菌性食物中毒事件中副溶血性弧菌已居于首位[2]。2006-2011年浙江省共報告食物中毒突發事件106 起,以微生物類事件為主(占67.92%)，副溶血弧菌為最常見致病菌(占33.33%)[3]。2013年浙江省食源性疾病監測項目中副溶血性弧菌檢出率最高，為3.7%，血清型以O3∶K6和O4∶K8為主。寧波市食源性疾病監測項目顯示，副溶血性弧菌為散發性腹瀉的主要病原，2013年在992份糞便和肛拭子中檢測到50份陽性樣品，陽性率為5.04%。耐熱直接溶血素(Thermostable direct hemolysin, TDH)和耐熱直接溶血素相關溶血素 (TDH-related hemolysin, TRH)是其主要致病物質，可引起腸袢腫脹、充血和腸液潴留而導致腹瀉[4-5]。目前在浙江省的副溶血性弧菌臨床株中發現了ST3、ST120和ST8[6]。為掌握寧波地區臨床株副溶血性弧菌毒力基因分布以及分子分型特征，特進行相關研究，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株分離 將食物中毒和急性腹瀉患者糞便或肛拭子直接接種TCBS培養基，37 ℃培養24 h，挑選可疑菌落進行革蘭染色、氧化酶試驗和觀察動力。動力陽性氧化酶試驗陽性的陰性弧采用法國生物梅里埃公司的VITEK-32儀器進行系統生化鑒定。

1.2 引物合成 tdh上游引物tdh-f: 5′- CGGTTCTGATGAGATATTGT-3′和下游引物tdh-r：5′- TCTGGAGTTTCATCCAAATA-3′,擴增產物為363 bp；trh基因上游引物trh-f：5′-TCAGTATCTAAATCATTCGC-3′和下游引物trh-r：5′-CATAACAAACATATGCCCAT-3′，擴增產物為471 bp；多位點序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)擴增和測序引物參考文獻[7]。

1.3 副溶血性弧菌基因組DNA的提取 采用Takara公司的MiniBEST細菌基因組DNA提取試劑盒(3.0版)，按照試劑說明書提取副溶血性弧菌基因組DNA。

1.4 tdh和trh檢測 采用Takara公司Premix TaqTM(2.0版) 試劑盒，按照試劑說明書配制PCR反應體系。tdh擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環；72 ℃ 10 min。trh擴增條件：退火溫度為58 ℃，其余同上。取擴增產物10 μL點樣于1%瓊脂糖凝膠(內含溴化乙錠最終濃度為0.5 μg/mL)，電壓10 V/cm，電泳30 min，暗室內紫外光下(波長254～365nm)觀察電泳結果，觀察是否有預期分子量大小的條帶出現。

1.5 副溶血性弧菌MLST擴增、測序和數據分析 副溶血性弧菌MLST方法參考文獻[7]，選擇副溶血性弧菌的7個管家基因adk、fumc、gyrB、icd、mdh、purA 和recA 進行PCR，擴增產物利用ABI3730全自動基因分析儀(上海英駿公司)采用測序引物對擴增的片段進行正反方向核苷酸序列測定，測序結果利用軟件Chromas編輯和拼接，利用軟件Bioedit進行校正，校正后的序列與副溶血弧菌MLST標準數據庫(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)進行比對，獲得各管家基因的等位基因數值，并形成相應的等位基因譜，判斷其序列型(sequence type,ST)。利用Mega6.0對7個管家基因核苷酸串聯序列構建系統進化樹，利用eBURST V3軟件對ST進行分析。參考菌株來自副溶血弧菌MLST標準數據庫。

2 結 果

2.1 tdh和trh毒力基因分析 2006—2012年共分離到248株副溶血性弧菌臨床株，選擇48株菌株進行毒力基因和MLST分型研究，2006年10株，均來自于一起食物中毒事件，2007年8株，2009年10株，2010年6株，2011年5株，2012年9株。48株菌株中42株tdh+，為93.75%；trh+11株，為22.92%；9個菌株為tdh+/trh +，4個菌株為tdh-/trh-。

2.2 副溶血性弧菌MLST分型結果 48株菌株可分為10個ST型。ST為3的菌株有32株，占66.67%；其次為ST為265的菌株有5株，占10.42%；ST為120的菌株有3株，占6.25%。2012年分離的F2012289菌株7個管家基因的等位基因分別為dnaE234、gyrB4、recA162、dtdS222、pntA、pyrC184和tnaA79，在數據庫中無匹配的ST。菌株毒力基因分布與MLST分型結果見表1。

2.3 副溶血性弧菌臨床株eBURST V3軟件分析結果 從副溶血弧菌MLST標準數據庫選擇中國分離的副溶血性弧菌臨床株作為參照，利用eBURST V3軟件繪制菌株ST分布圖。數據庫中中國副溶血性弧菌臨床株共有105株，分為84個ST。其中ST為3的菌株有12株，占11.43%；ST為8的菌株有3株,占2.86%。在寧波臨床株中發現特殊的ST262，在全國其他地區臨床株中未出現。

2.4 7個管家基因連接序列Mega6.0軟件分析結果 47個能進行ST分型的菌株按照形成ST的順序將7個管家基因連接成長度為3 682 bp的多基因序列，利用Mega6.0軟件采用Maximum Likelihood方法繪制系統進化樹。從圖中可知47株臨床株在進化樹上位于3個主要的分支上，7個管家基因中recA的變異最大。具體結果見圖2。

3 討 論

TDH具有溶血活性、細胞毒性、心臟毒性以及致死性等生物學活性，是副溶血性弧菌的主要毒力因子，與副溶血性弧菌的致病力具有高度相關性[4,8]。TRH具有溶血作用和腸毒素作用，是副溶血性弧菌的另一個重要的毒力因子。在48株寧波臨床株中tdh+為93.75%，占據優勢地位，與菌株致病性高度相關；trh+為22.92%；9個菌株為tdh+ /trh+,這與多篇文獻報道的臨床分離株中大多為tdh+/trh-，少量為tdh+ trh+的實驗結果相一致[9-10]。4個菌株為tdh- /trh-，楊小蓉等對不攜帶tdh或trh的菌株進行小鼠毒力實驗, 表明不攜帶毒力基因的菌株也具有致病性[11]。因此僅僅根據能否檢測到tdh或trh毒力基因來判斷菌株是否具有致病性是錯誤的。

表1 副溶血性弧菌毒力基因和MLST分型結果

注：數字表示ST，綠色為寧波臨床株特有ST，黑色為全國臨床株ST，紅色為兩種來源均有。

全球副溶血性弧菌已經有610種ST型，5種ST型最為常見(ST3、ST36、ST34、ST83和ST8)[7]。按照ST單點變異型(single-locus variant,SLV)值≥3為一個克隆群，具有最大SLV值的ST為主要起源，經eBURST V3分析顯示，中國臨床株ST分布存在3個克隆群(ST3、ST120和ST345)，最大克隆群為ST3并且是主要起源克隆群(SLV=8)。從圖2可知ST3克隆群2006—2012年在寧波臨床株中一直處于優勢地位，與以上結果保持一致。2006年分離的9個菌株來自于一起食物中毒事件，這9個菌株均為tdh+/trh-菌株，且ST均為3，本研究表明該起食物中毒可能由單一ST菌株引起。

注：菌株名稱前數字為ST,右側條圖黑線表示與1號菌株相比該處核苷酸有差異。

與全國其他地區臨床株比較，寧波有1個特殊的ST262。ST262菌株分離自2011年，只有1株，在副溶血弧菌MLST標準數據庫中查詢得知，該型菌株1984年首次在日本腹瀉病人中分離到，1990年和1991年在泰國腹瀉病人中檢出，在我國是首次報道分離到該型菌株。ST265菌株在1990年泰國腹瀉病人和2007年中國環境中分離到，在2007—2012年深圳的食源性疾病監測中127株副溶血性弧菌中有14株ST265[12]。本次研究在48株菌株中檢測到5株，分離年份為2007年、2009年、2010年和2012年，說明該型菌株除了在環境中存在外，還能在腹瀉病人中流行。ST265屬于ST345克隆群，而寧波和深圳均未發現ST345菌株，ST265可能是ST345克隆群在中國的主要流行株。

寧波地處我國東部沿海，這里的人們喜歡生吃半生吃各種小海產品，是副溶血性弧菌感染的高發區，與臨近的日本、泰國等地交流頻繁，因此掌握副溶血弧菌分子流行特征對副溶血弧菌的主動監測、暴發調查和追蹤溯源具有十分重要的意義。

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Virulence gene detection and multi-locus sequence typing ofVibrioparahaemolyticusfrom patients in Ningbo, China

GAO Hong,SONG Qi-fa,XU Jing-ye,ZHENG Jian,SHEN Xuan-yi

(NingboCenterforDiseaseControlandPrevention,Ningbo315010,China)

To investigated the toxin genes distribution and molecular characteristics ofVibrioparahaemolyticusfrom patients in Ningbo,V.parahaemolyticusstrains were collected from patients with food poisoning and diarrhea. Thermostable direct hemolysin gene (tdh) and TDH-related hemolysin gene (trh) were detected by polymerase chain reaction (PCR). Molecular characteristics were acquired by multi-locus sequence typing (MLST). Of 248 clinical strains were isolated from 2006 to 2012. Forty-eight strains were selected to detect virulence genes and MLST genotyping. Forty-two isolates were detected as tdh+ and 11 isolates were detected as trh+. There were 9 STs and one undifferentiated type in Ningbo clinical strains. Thirty-two strains were classified into ST3, 5 strains into ST265 and 3 strains into ST120. ST265 was found in Ningbo strains compared with strains from other regions of China. Strains with tdh+ accounted for the majority in Ningbo clinical strains. Twenty-five strains of ST3 clone were tdh+/trh-. There were 9 STs coexsited in Ningbo clinical strains. ST3 clone was dominant, followed by ST265 and ST120. Strains with tdh+/trh- were dominant in the ST3 clone. The unique ST262 was found in Ningbo clinical strains.

Vibrioparahaemolyticus; tdh; trh; multi-locus sequence typing

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.011

寧波市科學技術局基金項目資助(No.2012B82018，No.2011C50041)

寧波市疾病預防控制中心，寧波 315010; Email：gaohong@nbcdc.org.cn

R378.3

A

1002-2694(2015)03-0240-04

2014-07-16；

2014-09-24