免疫比濁法與離子交換層析微柱法測定糖化血紅蛋白的方法學比較

楊 軍

(四川省自貢市第四人民醫院檢驗科，四川 自貢 643000)

免疫比濁法與離子交換層析微柱法測定糖化血紅蛋白的方法學比較

楊 軍

(四川省自貢市第四人民醫院檢驗科，四川 自貢 643000)

目的 對免疫比濁法與離子交換層析微柱法定量檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)進行方法學比較。方法 采用免疫比濁法和離子交換層析微柱分別對同一標本做HbA1c含量檢測，比較兩種方法的精密度、準確性、線形范圍、相關性和單位樣本測定時間。結果 免疫比濁法精密度和重復性較好，與離子交換層析微柱法差異無統計學意義(P> 0.05)；免疫比濁法和離子交換層析微柱法具有較高相關性(r=0.9540，P< 0.01)。測得正常組、糖尿病A組、糖尿病B組的HbA1c值差異有統計學意義(P< 0.05)。結論 兩種方法測定HbA1c均具有較高的精確度和重復性，但免疫比濁法操作更簡單，要求標本量少，可作為自動化檢測HbA1c的首選方法。

糖化血紅蛋白；免疫比濁法；離子交換層析微柱

糖尿病的檢測指標有血糖測定、尿糖測定、OGTT等，而糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)作為糖尿病長期監測指標日益受到重視[1]。HbA1c是由血紅蛋白(hemoglobin，Hb)β鏈氨基末端頡氨酸殘基與葡萄糖醛基非酶促反應縮合而成，糖尿病時可占Hb總量的8%～30%。其糖鏈結構為α2(β-G)2，半衰期為60天，其形成取決于血糖濃度和作用時間，與血液中葡萄糖濃度成正比，可反映患者近2～3月血糖水平。故HbA1c檢測對糖尿病的診斷和治療有重要價值。離子交換層析微柱法為目前檢測HbA1c的主要方法，但其方法比較煩瑣、費時，而且成本比較高。本研究采用免疫比濁法檢測HbA1c，并與離子交換層析微柱法比較。

1 對象與方法

1.1 檢測對象 經臨床確診的本院門診和住院糖尿病患者50例(糖尿病組)，均符合1985年WTO的診斷標準，其中男26例，女24例，年齡(48±14.3)歲，空腹血糖6.8～12.0 mmol/L者33例(A組)，>12.0 mmol/L者17例(Β組)。同期健康體檢者(正常組)50例，排除糖尿病、肝病和其他內分泌疾病，男27例，女23例，年齡(34.53±7.49)歲。

1.2 儀器與材料 HbA1c免疫比濁法試劑盒為Tina-quant，HbA1c(Roche，批號為1822039)，試劑成分為HbA1c抗體、HbA1c多聚半抗原及緩沖液等。標準品由Roche提供。微柱法測定試劑(Biosystem提供)主要成分為低離子強度弱酸性陽離子交換樹脂微柱，洗脫液(洗脫液A：磷酸鹽緩沖液pH 7.0；洗脫液B：磷酸鹽緩沖液pH6.7)以及溶血素組成。主要儀器有Biosystem BTS 330分光光度計，全自動生化分析儀OLYMPAS 2700。

1.3 方法 ①免疫比濁法：取溶血劑于室溫放置幾分鐘。毛細血管血20 μl和2.0 ml溶血劑或肝素(EDTA)抗凝血10 μl和溶血劑1.0 ml，輕搖混勻1～2分鐘后待混合物變為淺褐色可用。取溶血標本0.5 ml上機操作。HbA1c%=(HbA1c含量/總Hb含量)×100%。②離子交換層析微柱法：所有試劑及標本于室溫放置10分鐘。取EDTA抗凝血50 μl和溶血劑200 μl充分混勻制成Hb溶液，將此溶液50 μl加入預先沉淀好的微柱中，200 μl洗脫液A預洗，再加洗脫液A 2.0 ml洗脫。最后用洗脫液B 4.0 ml收集并以去離子水調零在415 nm處測定吸光度值AHbA1c。取溶血樣品10 μl加上洗脫液B 2.4 ml，混勻，去離子水調零在415 nm處測定吸光度值AHbTOTAL。HbA1c%=AHbA1c/(3×AHbTOTAL)×100%

2 結果

2.1 HbA1c測定結果 如表1所示，兩種方法均顯示糖尿病A、B組HbA1c明顯高于正常組(P< 0.05)，但A、B組之間差異無統計學意義(P> 0.05)。

表1 3組HbA1c測定結果 (%)

﹡與正常組比較，P< 0.05

2.2 線性范圍 取已知濃度的標本作等比稀釋并作相關分析，HbA1c的檢測范圍：免疫比濁法為6～20 g/L，離子交換層析微柱法為8～24 g/L，Hb的檢測范圍前者為60～200 g/L，后者為50～180 g/L。當Hb含量正常時HbA1c的線形范圍是前者2%～20%，后者3%～18%。

2.3 精密度 正常人和糖尿病患者抗凝血各一份，HbA1c分別為(5.98±0.09)%、(9.40±0.11)%，分別重復測定20次，批內CV值：免疫比濁法為1.40%和1.15%，離子交換層析微柱法為1.5%和1.3%。兩份EDTA抗凝血，HbA1c分別是(5.04±0.12)%和(8.62±0.15)%，各分裝20份4 ℃保存，每天測各一次，連續測定10天，結果日間CV值：免疫比濁法為2.82%和2.57%，離子交換層析微柱法為2.97%和2.74%。免疫比濁法符合精確實驗方法標準。

2.4 準確性 HbA1c分別為4.8%、6.9%、10.7%的三份低、中、高標本中加入HbA1c標準品0.83 g/dl和2.54 g/dl重復測定三次：免疫比濁法、離子交換層析微柱法的平均回收率分別是100.4%和100.9%。

2.5 方法學比較 對結果進行數據統計，得出回歸方程。免疫比濁法與離子交換層析微柱法得出的結果一致。經過相關處理，其相關系數r=0.9540，P< 0.01，回歸方程為Y=0.9405X+0.0205。

2.6 單位樣品測試時間 準備時間：免疫比濁法與離子交換層析微柱法分別要1～2 min和15～20 min；實驗時間：各需要10 min和165～215 min。

3 討論

HbA1c作為糖代謝的長期監測指標重要性毋庸質疑，測定方法有多種如離子交換樹脂微柱層析法、高壓液相法、瓊脂凝膠電泳法、等電點聚集法、親和色譜微柱法、放射免疫法、離子捕獲法、等電聚焦與毛細電泳系統、TBA比色法、電泳質譜測定法(ESMS)、不連續親和電泳法等，不同的方法測定的HbA1c值不盡相同，可比性較差[2]。HbA1為HbA1a、HbA1b、HbA1c等亞單位的混合物，HbA1c為主要成分。測定過程中存在眾多干擾因素(FHb、HbE、HbH、HbS、遺傳變異Hb及其降解產物)。隨著生活條件的改善，糖尿病的發病率在逐年上升，對于糖尿病的診斷和治療及療效觀察，建立一種處理標本簡便、速度更快、重復性好、尤其是特異性高、干擾因素少從而滿足臨床需要的方法勢在必行。

免疫比濁法是應用小鼠單克隆抗Hbβ鏈糖化氨基末端的特異性抗體與標本中的HbA1c作用形成抗原-抗體復合物，再通過多聚半抗原與剩余的抗Hb抗體結合形成一種較穩定的多聚半抗原-抗體復合物，在531nm波長測定時吸收增加，形成濁度。反應液濁度的變化與標本中的HbA1c的濃度成反比，通過標準曲線測得HbA1c的值。另采用氰化高鐵法測定標本中Hb總量，并計算HbA1c占Hb的百分比。離子交換層析微柱法是利用帶有負電荷的低離子強度弱酸性陽離子交換樹脂與帶正電荷的Hb及HbA1c有親和力，但由于HbA1c的兩個β鏈N末端被糖基清除，正電荷較Hb少，兩者對樹脂的親和力不同。用磷酸緩沖液過柱，最后用高離子強度分離試劑分離HbA1c，在415 nm波長測定，并計算HbA1c占Hb的百分比。

兩種方法的批間CV值和批內CV值均小于1.5%和5%，已經達到美國國立醫院建立的HbA1c的檢測標準[3]，可以作為糖尿病患者的檢測手段。離子交換層析微柱法作為臨床上常用的方法，無需要貴重儀器設備，可以被大多數臨床實驗室接受且與參比方法相關性較好。但是操作完全依賴手工，費時費力，檢測易受HbF、HbS的影響[4]，且檢測時受到溫度的影響較大，每次測定都需要作標準對照管。免疫比濁法適用于自動化分析、速度快、標本處理簡單、適應臨床上越來越多的標本的需要，與參比方法HPLC具有高度相關性[5]。

免疫比濁法與離子交換層析微柱法平行測定發現本組實驗免疫比濁法測定值偏低，正常對照組免疫比濁法與離子交換層析微柱法分別是(4.87±0.37)%和(5.32±0.41)%；糖尿病A組是(9.23±0.41)%和(9.23±0.41)%；B組是(11.02±0.43)%和(11.15±0.47)%。除去方法學上的差異外，重要的原因是免疫比濁法是應用抗Hbβ鏈糖化氨基末端的特異性抗體與標本中的HbA1c作用形成抗原-抗體復合物，再通過多聚半抗原與剩余的抗Hb抗體結合形成一種較穩定的多聚半抗原-抗體復合物，形成濁度。因此對于N末端的順序特異性要求更高。且研究表明其不受HbA2、HbS、HbF、遺傳Hb、HbE、HbH和HbC的影響[6～8]。

免疫比濁法的標本可以采用毛細血管采血，簡單快捷，采血量少，可隨機采血進行單個樣本的測定，研究表明毛細血管血和靜脈血HbA1c，其結果無差異[9]。因而極大地方便了醫生和患者，可以使患者免于靜脈穿刺的困難和痛苦，更適用于門診和急診的需要，方便老年和幼兒患者，對于正在輸注葡萄糖液體以及各種昏迷休克等危重患者、妊娠糖尿病患者提供快捷準確的實驗證據。

兩種方法的單位標本時間的比較顯示：免疫比濁法的標本預處理簡便而時間短。實驗的平均時間更是只有離子交換層析微柱法的10%，速度更快，效率更高，在臨床標本日益增多的今天，前者無疑更具優勢。因此采用免疫比濁法測定HbA1c，結果準確可靠、靈敏度高、穩定性強、不易受到干擾物質的影響，標本處理簡單快捷、可以使用毛細血管取血、適合自動化分析，是適合目前臨床需要的首選方法。

[1] McDonald TJ，Warren R.Diagnostic Confusion？ Repeat HbA1c for the Diagnosis of Diabetes[J].Diabetes Care，2014，37(6)：135-136.

[2] Weykamp C.HbA1c：a review of analytical and clinical aspects[J].Ann Lab Med，2013，33(6)：393-400.

[3] Knaebel J，Irvin BR，Xie CZ.Accuracy and clinical utility of a point-of-care HbA1c testing device[J].Postgrad Med，2013，125(3)：91-98.

[4] 羅莎，郭健.糖化血紅蛋白檢測標準化[J].實用醫院臨床雜志，2012，9(3)：8-11.

[5] Rhea JM，Koch D，Ritchie J.Unintended reporting of misleading Hb A(1c)values when using assays incapable of detecting hemoglobin variants[J].Arch Pathol Lab Med，2013，137(12)：1788-1791.

[6] 周保衛.競爭性透射免疫比濁法和高效液相色譜法分別測定糖尿病者糖化血紅蛋白的結果分析[J].吉林醫學，2014，56(12)：2529-2530.

[7] Succari M，Fonfrede M，Laguillier C.Interference of hemoglobin variants on glycated hemoglobin measurement using Architect ci8200 immunoassay(Abbott Diagnostics)[J].Ann Biol Clin，2009，67(5)：557-562.

[8] Andrew W，Bernard S，Victor AL，et al.Evaluation of an immunoturbidimetric Assay for Hemoglobin A 1c[J].Clinical Biochemisity，1995，28(1)：97-100.

[9] 劉陽，李英杰，喻紅波，等.膠乳增強免疫比濁法測定糖化血紅蛋白的方法學評價[J].現代檢驗醫學雜志，2013，28(6)：101-103.

R446.6

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1672-6170(2015)01-0100-03

2014-06-20；

2014-08-10)