促肝細胞再生磷酸酶-3及整合素β1在食管鱗狀細胞癌中的表達及意義

陳 星，成爭艷，王 凱，孫明偉

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院城東病區 a.創傷外科，b.病理科，四川 成都 610101)

促肝細胞再生磷酸酶-3及整合素β1在食管鱗狀細胞癌中的表達及意義

陳 星a，成爭艷b，王 凱a，孫明偉a

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院城東病區 a.創傷外科，b.病理科，四川 成都 610101)

目的 探討促肝細胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3)及整合素β1(integrinβ1，Intβ1)在食管鱗狀細胞癌中的表達及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學法和實時熒光定量PCR檢測食管癌組織、癌旁組織和正常組織中PRL-3 和Intβ1的表達水平。結果 在蛋白水平和基因水平檢測均發現癌組織中PRL-3 和Intβ1的表達高于癌旁組織(P< 0.05)和正常組織。結論 PRL-3 和Intβ1在食管鱗狀細胞癌組織中表達增高，可能作為腫瘤標志物來監控食管鱗狀細胞癌的發生、發展、浸潤和轉移。

食管鱗狀細胞癌；促肝細胞再生磷酸酶3；整合素β1

食管癌世界標準化死亡率為23.40/10萬，占各種癌癥死亡的23.53%，僅次于肺癌、胃癌，居第三位[1]。。但是其發病的分子機制仍不清楚[2]。促肝細胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3)有促進細胞的生長、遷移和浸潤的作用[3]，特別是在腫瘤的轉移中起關鍵作用。整合素β1(integrinβ1，Intβ1)可使細胞間的黏附能力下降[4]，從而促進腫瘤組織的浸潤轉移。目前PRL-3及Intβ1與食管癌的關系研究較少，而兩者在食管癌中基因和蛋白水平的定量分析及兩者的相關性在國內鮮有報道。本研究采用免疫組織化學法和實時熒光定量PCR檢測PRL-3及Intβ1在食管癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達，觀察其在食管癌發生、發展、黏附和浸潤轉移中的作用，為臨床預測食管癌轉移潛能和預后及治療提供客觀有效的指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 用于免疫組化檢測的40例食管鱗狀細胞癌組織來源于我院病理科2010年1月至2013年12月胸外科手術切除標本。其中高分化鱗狀細胞癌20例，中分化鱗狀細胞癌13例，低分化鱗狀細胞癌7例。并且取相應的癌旁組織(距腫瘤邊緣1.0 cm處黏膜組織)及正常組織(距腫瘤邊緣5.0 cm處黏膜組織，經鏡下觀察未發現癌細胞)。用于Real-time PCR的12例新鮮食管癌組織、癌旁組織及正常組織取自2012年1月至2013年11月我院胸外科手術切除標本。其中高分化鱗狀細胞癌5例，中分化鱗狀細胞癌4例，低分化鱗狀細胞癌3例。所有患者術前均未接受任何治療，平均年齡61.2歲(45～76歲)。12例新鮮組織切除后立即放入-70 ℃冰箱保存備用。

1.2 免疫組化 按照免疫組化二步法檢測試劑盒說明進行操作，測定PRL-3和 Intβ1的表達。切片常規脫蠟至水，高壓抗原修復，PRL-3單克隆抗體及Intβ1單克隆抗體(美國Santa Cruz公司鼠抗人)4 ℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復染。用PBS代替一抗作為陰性對照。在高倍鏡下觀察切片，隨機選取5～6個視野拍照，結果采用Image Pro 6.0圖像分析系統分析，測量平均光密度值(IOD)，各組進行比較。

1.3 實時熒光定量PCR

1.3.1 總RNA的提取 ①組織勻漿后加0.2 ml氯仿，劇烈搖蕩離心管15 s，室溫放置3 min后12 000 r/min 4 ℃離心10 min；②取上層水于新的離心管，加等體積異丙醇混勻，室溫放置10 min；③ 12 000 r/min離心10 min，棄上清液并以75%乙醇洗滌沉淀；④離心棄上清液后室溫干燥10 min，加50 μl RNase-free ddH2O充分溶解RNA備用。

1.3.2 cDNA的合成 取總RNA 500 ng進行逆轉錄，用美國Bio-Rad公司iScriptTM cDNA Synthesis Kit試劑盒，總體系10 μl：5×PrimeScript Buffer 2 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 10.5 μl，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μl，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μl，補DEPC水至10 μl；上PCR儀反轉錄，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.3.3 PCR擴增 引物序列如下：PRL-3上游引物5′-GGGACTTCTCAGGTCGTG TC-3′，下游引物5′-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3′。Intβ1上游引物5′-ACGAGGTCATGGTTCATGTTG-3′，下游引物5′-CCTCATACTTCGGATTG ACCA-3′。GAPDH上游引物5′-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3′，下游引物5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′。引物由上海生工合成，用大連寶生物TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒，反應體系25 μl。其中cDNA 2 μl，SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μl，dH2O 9.5 μl。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，循環條件：①95 ℃預變性10s后開始循環；②95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。檢測樣本PRL-3和 Intβ1的Ct值。根據其Ct值，用軟件ABI StepOne，按公式2-△△Ct計算出相對表達量，各組進行比較。

1.4 統計學方法 應用軟件包SPSS 17.0進行統計學分析。數據以均數±標準差表示；各組內表達的差異應用重復測量的方差分析對數據進行分析，P< 0.05為差異有統計學意義。用Pearson相關分析檢驗相關性，P< 0.05為有相關性。

2 結果

2.1 PRL-3及Intβ1蛋白表達水平與陽性細胞定位 40例食管癌組織中PRL-3陽性27例(67.5%)，Intβ1陽性29例(72.5%)的癌細胞胞質中出現淺黃色至棕褐色顆粒樣物，間質無著色(圖1a、圖2a)；相應的癌旁組織中PRL-3陽性表達15例(37.5%)，且陽性細胞均集中在不典型增生區域的細胞質中(圖1b)，Intβ1陽性表達16例(40%)(圖2b)；正常組織中PRL-3散在陽性13例(32.5%)(圖1c)，Intβ1散在陽性15例(37.5%)(圖2c)。PRL-3在癌組織、癌旁組織及正常組織中的IOD值依次降低，差異有統計學意義(P< 0.01)。Intβ1在癌組織中IOD值高于癌旁組織及正常組織IOD值，差異有統計學意義(P< 0.01)，見表1。

圖1 PRL-3的表達 a：癌組織；b：癌旁組織；c：正常組織(×400) 圖2 Intβ1的表達 a：癌組織；b：癌旁組織；c：正常組織(×400)

組織類型nPRL-3Intβ1癌組織400.185±0.004*0.187±0.003*癌旁組織400.179±0.0060.180±0.004正常組織400.173±0.0040.179±0.004

與癌旁組織及正常組織比較，*P<0.01

2.2 PRL-3和Intβ1的基因表達水平 PRL-3 mRNA在癌組織中相對表達量明顯高于癌旁組織及正常組織，差異有統計學意義(P< 0.01)。Intβ1 mRNA在癌組織、癌旁組織及正常組織中的相對表達量也依次降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 食管癌中PRL-3和 Intβ1基因表達 (%)

與癌旁組織及正常組織比較，*P<0.01

2.3 PRL-3和Intβ1表達的相關性 在蛋白表達水平，癌組織中PRL-3 和Intβ1表達呈正相關關系(r=0.412，P= 0.024)，癌旁組織中PRL-3和Intβ1表達亦呈正相關關系(r=0.446，P= 0.049)。在基因表達水平，癌組織及癌旁組織中PRL-3 與Intβ1表達均無相關性(r=-0.349，r=-0.137，P> 0.05)。

3 討論

PRL屬于酪氨酸蛋白磷酸酶家族成員，包括PRL-1、PRL-2、 PRL-3。PRL在正常組織中有不同程度的表達，但更多研究表明其與腫瘤細胞轉移密切相關[5，6]。目前已發現PRL-3在胃癌、卵巢癌、結直腸癌，肝癌的發生、侵襲、轉移中起重要作用[7～9]。PRL-3可通過調節酪氨酸的磷酸化和去磷酸化，進而調節細胞的生長、分化、信息傳遞等活動。同時PRL-3可通過激活細胞內的Rho、MAPK信號通路使細胞增殖和分化，提高浸潤轉移能力[10]。本實驗在蛋白和基因水平檢測了PRL-3 在正常食管黏膜組織、食管鱗狀細胞癌原發灶及癌旁組織中的表達情況，結果表明在食管鱗狀細胞癌中PRL-3 蛋白和基因在原發灶中的表達明顯高于癌旁組織，說明高表達的PRL-3 可能在食管鱗狀細胞癌發生轉移中起作用。

整合素是黏附分子五大家族成員之一，對細胞及其外基質的黏附起主要介導作用[11]。Intβ1是介導ECM信號的主要細胞表面受體，與其配體相結合可以促進細胞的黏附、增殖和遷移等作用。研究表明，Intβ1與多種腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移有密切關系[12，13]。本實驗檢測了Intβ1在蛋白和基因水平的表達情況，結果表明在食管鱗狀細胞癌中Intβ1 蛋白和基因在原發灶中的表達明顯高于癌旁組織，證明了Intβ1的高表達可能與食管鱗狀細胞癌黏附及侵襲增強有關。

PRL-3和Intβ1各種細胞外信號傳遞至細胞內主要依靠MAPK通路介導[14]，有研究顯示PRL-3可通過正調控PRL-3-整合素β1-ERK1/2-MMP-2信號傳導通路[15]增強Intβ1的表達，使腫瘤組織的活動性、侵襲性和轉移能力增強。本實驗結果顯示，在蛋白表達水平癌組織和癌旁組織中PRL-3 和Intβ1表達均呈正相關關系，說明其機制PRL-3可能通過活化通路提高Intβ1表達，從而增強細胞間質侵襲轉移的能力。在基因表達水平PRL-3 和Intβ1表達無相關性，可能由于mRNA翻譯成蛋白的滯后性及mRNA轉錄后調控機制的影響。綜上所述，PRL-3和Intβ1在食管鱗狀細胞癌中高表達，且在食管鱗狀細胞癌的發生、發展、浸潤和轉移起關鍵作用，可能作為腫瘤標志物來監測腫瘤、判斷預后，也有望成為治療腫瘤的靶點。

[1] 赫捷，邵康.中國食管癌流行病學現狀，診療現狀及未來對策[J].中國癌癥雜志，2011，21(7)：501-504.

[2] Kashyap MK，Marimuthu A，Kishore CJ，et al.Genomewide mRNA profiling of esophageal squamous cell carcinoma for identification of cancer biomarkers[J].Cancer Biol Ther，2009，8(1)：36-46.

[3] Stephens BJ，Han H，Gokhale V，et al.PRL phosphatases as potential molecular targets in cancer[J].Mol Cancer Ther，2005，4(11)：1653-1661.

[4] Yang J，Dai C，Liu Y.A novel mechanism by which hepatocyte growth factor blocks tubular epithelial to mesenchymal transition[J].J Am Soc Nephrol，2005，16(l)：68-78.

[5] Bessette DC，Qiu D，Pallen CJ.PRL PTPs：mediators and markers of cancer progression[J].Cancer Metastasis Rev，2008，27(2)：231-252.

[6] AI-Aidaroos AQ，Zeng Q.PRL-3 phosphatase and cancer metastasis[J].J Cell Biochem，2010，111(5)：1087-1098.

[7] Ren T，Jiang B，Xing X，et al.Prognostic significance of phosphatase of regenerating liver-3 expression in ovarian cancer[J].Pathol Oncol Res，2009，15(4)：555-560.

[8] Mayinuer A，Yasen M，Mogushi K，et al.Upregulation of protein tyrosine phosphatase type IVA member 3(PTP4A3/PRL-3)is associated with tumor differentiation and a poor prognosis in human hepatocellular carcinoma[J].Ann Surg Oncol，2013，20(1)：305-317.

[9] Bilici A，Ustaalioglu BB，Yavuzer D，et al.Prognostic significance of high phosphatase of regenerating liver-3 expression in patients with gastric cancer who underwent curative gastrectomy[J].Dig Dis Sci，2012，57(6)：1568-1575.

[10]Li Z，Zhan W，Wang Z，et al.Inhibition of PRL-3 gene expression in gastric cancer cell line SGC7901 via microRNA suppressed reduces peritoneal metastasis[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，348(1)：229-237.

[11] Hood JD，Cheresh DA.Role of integrins in cell invasion and migration[J].Nat Rev Cancer，2002，2(2)：91-100.

[12]Yao ES，Zhang H，Chen YY，et al.Increased beta1 integrin is associated with decreased survival in invasive breast cancer[J].Cancer Res，2007，67：659-664.

[13]Hazlehurst LA，Argilagos RF，Dalton WS.Beta1 integrin mediated adhesion increases Bim protein degradation and contributes to drug resistance in leukaemia cells[J].Br J H aematol，2007，136(2)：269-275.

[14]Kobel M，Pohl G，Schmitt WD，et al.Activation of mitogen-activated protein kinase is required for migration and invasion of placental site trophoblastic tumor[J].Am J Pathol，2005，167(3)：879-885.

[15]Peng L，Xing X，Li W，et al.PRL-3 promotes the motility，invasion，and metastasis of LoVo colon cancer cells through PRL-3-integrin β1-ERK1/2 and-MMP-2 signaling[J].Molecular Cancer，2009，24(8)：110-112.

Expression and significance of phosphatase of regenerating liver-3 and integrinβ1 in esophageal squamous cell carcinoma

CHENXinga，CHENGZheng-yanb，WANGKaia，SUNMing-weia

(a.DepartmentofThoracicSurgery，b.PathologyDepartment，EasternDistrict，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610101，China)

SUNMing-wei

Objective To investigate the expression and significance of phosphatase of regenerating liver-3(PRL-3)and integrinβ1(Intβ1)in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods The expression of PRL-3 and Intβ1 in esophageal squamous cell carcinoma，adjacent non-tumor tissues and normal esophageal tissues were detected by using an immunohistochemical analysis and a real-time PCR analysis.Results The mRNA and protein expressions of PRL-3 and Intβ1 were higher in the esophageal squamous cell carcinoma than that in the adjacent non-tumor tissues(P< 0.05).The lowest expressions of the two factors were found in the normal esophageal tissues.Conclusion PRL-3 and Intβ1 may be used as tumor markers in progression，invasion and metastasis of the disease.

Esophageal squamous cell carcinoma；Phosphatase of regenerating liver-3；Integrin β1

四川省衛生廳2013年科研項目(編號：130142)

孫明偉

R735.1；R365

A

1672-6170(2015)01-0049-03

2014-09-17；

20104-11-04)