Rho家族在腎臟足細胞細胞骨架調節中的作用

賀 蓉，李貴森

(1.遵義醫學院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院腎臟內科，四川 成都 610072)

Rho家族在腎臟足細胞細胞骨架調節中的作用

賀 蓉1，2，李貴森2△

(1.遵義醫學院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院腎臟內科，四川 成都 610072)

足細胞在腎小球疾病的發生和發展中有重要地位，尤其局灶性節段性腎小球硬化癥(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)等。FSGS 作為一種典型的足細胞病，其損傷可以發生在多個環節上，包括細胞骨架(cytoskeleton)的破壞、細胞核內轉錄因子的異常、胞漿內線粒體能量代謝異常、細胞內鈣離子動態穩定性的改變及裂孔隔膜上其他成分的異常等，其中足細胞骨架結構的變化是FSGS重要的發病機制。細胞骨架是真核細胞維持生命活動的重要成分，Rho家族(如RhoA、Cdc42、Rac1等)在細胞骨架動態變化調節中發揮著重要的作用。Rho 家族蛋白介導的信號通路異常可能影響足細胞的細胞骨架穩定，進而破壞足細胞的正常結構，從而導致FSGS的發生和進展。

局灶性節段性腎小球硬化癥；細胞骨架；Rho家族

足細胞在維持腎小球的結構和功能完整性中起重要作用。既往研究表明，幾種足細胞相關蛋白，如輔肌動蛋白4(a-actinin-4)[1]、腎病蛋白(nephrin)[2]、磷脂酶Cε基因(the phospholipase C epsilon gene)[3]和瞬時受體電位陽離子通道6(TRPC6)[4]等的編碼基因突變，會影響腎小球濾過屏障紊亂和肌動蛋白細胞骨架重排，導致腎臟疾病的發生，其中足細胞骨架的動態調控是維持腎臟正常濾過至關重要的的條件。微絲(microfilaments，MFs)和微管(microtubules，MTs)是細胞骨架的兩個主要系統，它們在細胞內形成支持網絡，進而維持細胞形態。傳統觀點認為，MTs 系統在細胞分裂和胞內運輸過程中起關鍵作用，而 MFs 對細胞遷移和貼壁等功能至關重要。最近研究發現，MFs 還可以調控細胞凋亡、衰老和基因表達，從而賦予了MFs 的細胞生長調控功能。在足細胞中，MFs結構是以肌動蛋白為基礎，并與α-actinin-4 、Synaptopodin 和肌球蛋白等共同組成具有精細調節和收縮作用的足細胞肌動蛋白微絲骨架。因此，穩定的肌動蛋白細胞骨架是維持足細胞正常結構和功能的首要條件[1]，而Rho家族中small GTPase分子如RhoA、Rac1以及Cdc42分子是調節細胞骨架的重要分子[5]。研究發現，在足細胞里表達的肌動蛋白調節蛋白(GTPase-activating protein，GAP)，通過與Rho家族中small GTPase分子RhoA、Rac1以及Cdc42作用，調節著細胞骨架的穩定[6]。本文主要對 Rho家族中small GTPase分子參與足細胞骨架的調節及致病作用作一綜述。

1 Rho家族

Rho GTPase是Ras超家族的成員之一，已發現Rho GTPase具有完全不同于Ras且甚至與Ras相反的功能作用。研究證實Rho GTPases是細胞骨架肌動蛋白的重要調節子并能影響脊椎動物細胞形態，且發現許多至關重要的細胞進程如通過c-JunN-末端激酶(JNK)信號通路的轉錄調節、誘導凋亡、細胞周期調控及維持Ras-轉染細胞的轉化表型等都涉及Rho GTPases[7～9]。與Ras相似，Rho GTPas-es能調節GDP/GTP循環改變，3種重要的蛋白有序地調控Rho蛋白的功能活性(圖1)：促進GDP向GTP轉化的蛋白-鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanosine nucleotide exchange factors，GEFs)；增加GTPase水解活性的蛋白-GAPs；抑制GDP解離的蛋白-GDP解離抑制因子(GDP dissociation inhibitors，GDIs)。

目前已從哺乳動物細胞中分離出16種不同的Rho GTPases，分別是Rac1、Rac2、Rac3、Cdc42、TC10、RhoA、RhoB、RhoC、RhoE/Rnd3、RhoG、Rnd1/Rho6、Rnd2/Rho7、RhoD/HP1、TTF/RhoH、Chp和Rif[10]。另外，發現GEFs和GAPs數目大量增加，每類均超過20個成員，這使Rho GTPase參與的信號通路的調控極為復雜。目前眾多的研究集中在Rho GTPases家族成員中的Cdc42、Rac1和RhoA分子。用哺乳動物成纖維細胞或其它細胞系統如白血病細胞和神經細胞為模型的研究，已確定上述幾種蛋白主要影響細胞骨架肌動蛋白[11]。在成纖維細胞，Cdc42促進絲狀偽足的形成而有利于細胞對外環境的適應，Rac1調節層狀偽足的生成及膜皺縮，RhoA則促進焦點連接和張力纖維的裝配。

2 Rac1的作用機制

Racl全稱是 Ras 相關的 C3 肉毒素底物1(related C3 botulinum toxinsubstmte 1)，其基因全長 29kb，其定位于人染色體 7p22，包含 7 個外顯子，屬于 Rho家族蛋白中 Rac 亞家族成員之一[12]。Racl在細胞運動與黏附、細胞的增殖分化與凋亡、腫瘤的侵襲與轉移以及免疫調節等方面都發揮了重要的作用[13]。與其它小G蛋白相同，Rac1有兩種轉換形式，GDP失活狀態與GTP活性狀態，而Rac1的GDP與GTP形式的轉換是GAPS調節的結果(圖2)。如Rho GTP酶激活蛋白 1(RhoGAP1)、RICS Rho GTP酶激活蛋白32(p200RhoGAP)、Rho GTP酶激活蛋白9(ARHGAP9)、活性BCR相關基因(Active BCR-related gene，ABR)、斷裂點簇集區(Breakpoint cluster region，BCR)、嵌合素(Chimerin 2，B-chimaerin)和RalA結合層白1(RalA binding protein 1，RalBP1)，它們激活Rac1，從而抑制G-proteins。抑制GDP解離的蛋白GDIs，如RhoGDI alpha 和LyGDI 都在細胞骨架系統里發現，Rac1的GDP形式通過GDIs調節，具體機制現在不清楚，同時GEFs促使Rac1的GDP形式的形成，GEFs包括DBL、Tiam1、ECT2、ARHGEF2等相關因子。GAPs、GEFs、與GDIs的活性受多種因子的調節，目前它們確切的通路研究還不是很清楚[14，15]。哺乳動物的Rho GTP酶Rac1與 Cdc42的是控制許多細胞活動的分子開關，但最顯著的是它們在肌動蛋白的調控中對細胞骨架的動態調節。

足細胞復雜的細胞骨架系統的穩定是維持腎臟濾過屏障的基礎。對于Rac1在生理狀態下及病理狀態下維持足細胞細胞骨架中的作用也做了一些研究。有研究表明，采用足細胞特異性表達Cre-LOX的技術，使有正常足細胞形態的小鼠缺失Rac1，但發育到成年后，足細胞的功能未受影響；但是構建急性足細胞損傷的硫酸魚精蛋白的模型，使足細胞Rac1特異性缺失，足細胞足突突融合受到了阻礙；而且在慢性高血壓腎小球損害的模型，Rac1的喪失導致蛋白尿出現和腎小球硬化程度加劇[16]。另一個研究表明[17]，Rac1的激活阻礙了足細胞的成熟，ARHGAP24基因，屬于GTP酶激活蛋白中的一種蛋白，被發現它的突變形式與人類家族性FSGS有密切的關系，ARHGAP24通過影響RhoA信號通路下游的因子，抑制Rac1的活性和偽足形成；在小鼠的足細胞中敲除ARHGAP24基因后增強的細胞膜的邊緣波動性，也增加了Rac1和Cdc42的活性；另有研究發現，缺乏Rho GDP解離抑制因子(RhoGDIα，使Rho家族處于非活性狀態)的小鼠，出現了大量的蛋白尿，足突融合[18，19]。

3 Cdc42的作用機制

Cdc42全稱為細胞分裂周期蛋白42(celldivision cycle 42)，大小為25×103，又稱G25k。其基因定位于1p36.1。Cdc42是一種鳥嘌呤三核苷酸(GTP)酶，像Ras超家族的所有成員一樣，Rho家族蛋白在非活性GDP結合形式和活性GTP結合形式之間循環(圖2)，Cdc42的GEFs包括FYVE、RhoGEF、FGD1、Frabin、ECT2、ASEF2、DOCK6、Zizimin1、DOCK11、DBS、DEF6、DBL、ACK1。GAPs通過催化水解GTP為抑制Cdc42的活性，主要的GAPs包括RHG7、Rich1、CDGAP、BCR、ABR、RalBP1、B-chimaerin、DAG、p200RhoGAP、Fyn、RhoGAP5、p120gAP、FGFR1 NIP2及RhoGAP1[20，21]。Rho GDP 解離抑制因子RhoGDI alpha、LyGDI、RhoGDI gamma 抑制Cdc42的活性，Cdc42在腫瘤方面研究比較多，以往的研究表明Cdc42在肝癌中、肺部腺癌中、胃癌中高表達[21]。Cdc42 蛋白在細胞骨架動態變化調節中發揮著重要的作用，而細胞骨架的變化影響細胞的各種功能，突出影響到細胞遷移與細胞極化[22]。Cdc42 蛋白對細胞骨架動態變化的調節是一個復雜的信號傳遞過程，涉及到 Rho 家族蛋白介導的信號通路以及其他多條信號通路間的相互作用。Cdc42 蛋白通過誘導細胞肌動蛋白聚合，對肌動蛋白細胞骨架發揮調節作用。Cdc42 蛋白能調節肌動蛋白聚合的信號傳導過程如下：Cdc42 蛋白激活p65PAK 蛋白激酶，使后者獲得絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，導致與 p65PAK 蛋白結合的肌動蛋白發生重排[23，24]。

研究表明，敲除Cdc42的小鼠足細胞兩周后出現蛋白尿，并且與正常足細胞足突架構相關連的nephrin 和 podocin蛋白在足細胞上異常分布，進而影響細胞骨架的結構。緊接著腎小球硬化，腎小管間質嚴重損傷，進一步腎功能衰竭而死亡。足細胞缺乏Cdc42而Rac1正常的小鼠，絲切蛋白處于非磷酸化水平；因為Cdc42可以激活LIM激酶以促進絲切蛋白磷酸化，磷酸化的絲切蛋白可以與肌動蛋白結合進而發揮作用；另有研究發現，在腓骨肌萎縮神經病變和FSGS的患者中發現了INF2基因的突變，在HEK-293T細胞中定點突變INF2后發現，Cdc42的活性增強并與突變的INF2結合，這樣導致了Cdc42的錯誤定位并加劇了細胞骨架系統的瓦解[25，26]。

4 RhoA的作用機制

細胞骨架結合蛋白之一的 RhoA 蛋白，是細胞內重要的信號轉導分子之一，具有 GTP 酶活性。文獻報道，RhoA 主要通過調控 MFs 的重組參與細胞增殖、遷移和凋亡等過程。RhoA途徑可以被不同的GEFS激活(圖2)，如胰島素樣生長因子-1(IGF-1)信號分子，促進胰島素樣生長因子1受體(IGF-1 receptor)的活化，并形成復雜的Rho(GEF)12(LARG)的形式，G蛋白家族α-Q/ 11和α-12可以與LARG結合從而促進RhoA的激活，活性的RhoA可刺激PTK2蛋白質酪氨酸激酶2(FAK1)，磷酸化LARG，從而提高的RhoA的活性，此外，G蛋白的α-12家族可以通過刺激的Rho GEF 1[ARHGEF1(p115RhoGEF)]從而激活RhoA；肝配-A與肝配-A受體結合，并與神經元鳥嘌呤核苷酸交換因子(Ephexin)結合，從而激活RhoA；研究發現，有幾種GAPs參與Rho的負性調節[27]：肌球蛋白IXB，Rho GTP酶激活蛋白26(GRAF)，Rho GTP酶激活蛋白1(RhoGAP1)和Rho GTP酶激活蛋白(p200RhoGAP)；p200RhoGAP與p250 gAP，它與RhoA呈負性調節關系，研究表明，ARHGAP32基因為神經元RhoGAP蛋白，并被Fyn磷酸化[28～30]。Fyn是Src家族的蛋白酪氨酸激酶的成員，在神經元和少突膠質細胞之間發揮重要的作用。在少突膠質細胞中，磷酸化似乎增強p250 gAP和Fyn的之間的相互作用。此外，p250 gAP的酪氨酸磷酸化的水平增加時的少突膠質細胞系CG4的分化，Fyn的激活，使少突膠質細胞成熟上調，因此 p250 gAP由Fyn酪氨酸磷酸化并調節RhoGAP活性，導致少突膠質細胞的形態和表型的改變。足細胞是間充質樣細胞，在腎臟發育時期起源于上皮前體，它由形態和功能不同的三部分組成，分別是細胞體、主要突起和足突，足突上含有肌動蛋白細胞骨架并與腎小球基底膜相連，腎小球上皮細胞，足突，腎小球基底膜組成了腎臟濾過的最后一道防線，人突觸足蛋白(Synaptopodin)，是一種富含脯氨酸，與肌動蛋白相聯接，并在有活性的細胞成分如神經元的樹突和腎小球足突上表達的一種特異性蛋白[31]；因此人突觸足蛋白可以被描述為通過連接裂縫隔膜(SD)和基底膜域(BMD)并結合到輔肌動蛋白和肌動蛋白細胞骨架上發揮作用的一個支架蛋白，應力纖維是細胞骨架一個重要的組成成分，研究表明，Rho家族—特別是RhoA的激活，是形成應力纖維的一個重要的條件，RhoA的及其它小分子G蛋白的活性受核苷酸負荷的調節，在GTP形式下，Rho GTP酶獲得的活性構象，促使應力纖維的形成，反之，Rho家族的GDP形式促使G蛋白的失活[32，33]。

研究表明，在轉基因小鼠中用多西環素誘導足細胞的RhoA的活性形式發現：用多西環素誘導足細胞的RhoA活性形式的小鼠產生了顯著的蛋白尿；此外，蛋白尿的程度和腎小球的病理變化與RhoA的表達水平有關：在光鏡下，RhoA的表達水平低的一組沒有觀察到腎小球的節段性足突融合，而更高水平的RhoA活性的表達均觀察到廣泛的足突融合和局灶節段性腎小球硬化(FSGS)。此外，誘導RhoA的表達顯著上調纖維連接蛋白和膠原IA1的mRNA在腎小球的表達，上調的程度與蛋白尿的水平有關。對于大多數小鼠，多西環素的撤離導致蛋白尿的下降，除了一些大量蛋白尿的小鼠。這些數據表明，在足細胞中RhoA的活化形式會導致蛋白尿的產生并伴隨著腎臟一系列的病理變化最終發展為FSGS[34]。

圖2 Rho家族與足細胞骨架的關系

5 小結

細胞骨架的改變可以導致足細胞的裂孔的改變并介導細胞 F-actin 的重新分布。而Rho家族通過對肌動蛋白調控來實現對細胞骨架的動態調節。足細胞作為腎臟結構和功能中最重根據細胞之一，Rho家族分子，尤其是Rac1、cdc42和RhoA在維持其細胞骨架中起了重要作用。多種FSGS致病基因(如TRPC6、INF2、ARHGAP24等)的突變均可以影響Rho GTP酶的變化，從而通過破壞足細胞骨架的穩定性來致病。因此，深入研究細胞骨架的重要的信號分子RAC1、Cdc42、RhoA與FGGS突變基因的的關系，可以進一步了解FSGS的發病機制。

[1] Kaplan JM.Mutations in ACTN4，encoding alpha-actinin-4，cause familial focal segmental glomerulosclerosis[J].Nat Genet，2000，24(3)： 251-256.

[2] Blakey JD.Positionally cloned asthma susceptibility gene polymorphisms and disease risk in the British 1958 Birth Cohort[J].Thorax，2009，64(5)： 381-387.

[3] Hinkes B.Positional cloning uncovers mutations in PLCE1 responsible for a nephrotic syndrome variant that may be reversible[J].Nat Genet，2006，38(12)： 1397-1405.

[4] Wilson C，Dryer SE.A mutation in TRPC6 channels abolishes their activation by hypoosmotic stretch but does not affect activation by diacylglycerol or G protein signaling cascades[J].Am J Physiol Renal Physiol，2014，306(9)： 1018-1025.

[5] Faul C.Actin up： regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton[J].Trends Cell Biol，2007，17(9)： 428-437.

[6] Gasman S.Trimeric G proteins control exocytosis in chromaffin cells.Go regulates the peripheral actin network and catecholamine secretion by a mechanism involving the small GTP-binding protein Rho[J].J Biol Chem，1997，272(33)： 20564-20571.

[7] Compagnucci C.Rho-kinase signaling controls nucleocytoplasmic shuttling of class IIa Histone Deacetylase(HDAC7)and transcriptional activation of orphan nuclear receptor NR4A1[J].Biochem Biophys Res Commun，2014，291(14)：2198-2196.

[8] Duquette PM，Lamarche-Vane N.Rho GTPases in embryonic development[J].Small GTPases，2014，5(2)： 1-9.

[9] Jean L.The Rho family GEF Asef2 regulates cell migration in three dimensional(3D)collagen matrices through myosin II[J].Cell Adh Migr，2014，8(5)：460-467.

[10]Fu Z.Increased activity of Rho kinase contributes to hemoglobin-induced early disruption of the blood-brain barrier in vivo after the occurrence of intracerebral hemorrhage[J].Int J Clin Exp Pathol，2014，7(11)： 7844-7853.

[11]Beveridge RD.The leukemia-associated Rho guanine nucleotide exchange factor LARG is required for efficient replication stress signaling[J].Cell Cycle，2014，13(21)： 3450-3459.

[12]Shirai H，Autieri M，Eguchi S.Small GTP-binding proteins and mitogen-activated protein kinases as promising therapeutic targets of vascular remodeling[J].Curr Opin Nephrol Hypertens，2007，16(2)： 111-115.

[13]Poppe D.Azathioprine suppresses ezrin-radixin-moesin-dependent T cell-APC conjugation through inhibition of Vav guanosine exchange activity on Rac proteins[J].J Immunol，2006，176(1)： 640-651.

[14]Tan W.An essential role for Rac1 in endothelial cell function and vascular development[J].FASEB J，2008，22(6)： 1829-1838.

[15]Guo F.Rac GTPase isoforms Rac1 and Rac2 play a redundant and crucial role in T-cell development[J].Blood，2008，112(5)： 1767-1775.

[16]Faul C.Actin up： regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton[J].Trends Cell Biol，2007，17(9)： 428-437.

[17]Akilesh S.Arhgap24 inactivates Rac1 in mouse podocytes，and a mutant form is associated with familial focal segmental glomerulosclerosis[J].J Clin Invest，2011，121(10)： 4127-4137.

[18]Shibata S.Modification of mineralocorticoid receptor function by Rac1 GTPase： implication in proteinuric kidney disease[J].Nat Med，2008，14(12)： 1370-1376.

[19]Togawa A.Progressive impairment of kidneys and reproductive organs in mice lacking Rho GDIalpha[J].Oncogene，1999，18(39)： 5373-5380.

[20]Sinha S，Yang W.Cellular signaling for activation of Rho GTPase Cdc42[J].Cell Signal，2008，20(11)： 1927-1934.

[21]Zhao C.GC-GAP，a Rho family GTPase-activating protein that interacts with signaling adapters Gab1 and Gab2[J].J Biol Chem，2003，278(36)： 34641-34653.

[22]徐菊玲，邵圣文.Cdc42蛋白與細胞遷移、極化以及細胞骨架調節的關系[J].現代預防醫學，2011，38(6)： 1148-1149，1158.

[23]朱正.Rho蛋白家族的生物活性[J].國外醫學(生理、病理科學與臨床分冊)，2002，22(3)： 251-254.

[24]Ren XD，Kiosses WB，Schwartz MA.Regulation of the small GTP-binding protein Rho by cell adhesion and the cytoskeleton[J].EMBO J，1999，18(3)： 578-585.

[25]Blattner SM.Divergent functions of the Rho GTPases Rac1 and Cdc42 in podocyte injury[J].Kidney Int，2013，84(5)： 920-930.

[26]Mseka T，Bamburg JR，Cramer LP.ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization[J].J Cell Sci，2007，120(Pt 24)： 4332-4344.

[27]Lessey-Morillon EC.The RhoA guanine nucleotide exchange factor，LARG，mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration[J].J Immunol，2014，192(7)： 3390-3398.

[28]Kim O，Yang J，Qiu Y.Selective activation of small GTPase RhoA by tyrosine kinase Etk through its pleckstrin homology domain[J].J Biol Chem，2002，277(33)： 30066-30071.

[29]Walker SJ，Brown HA.Specificity of Rho insert-mediated activation of phospholipase D1[J].J Biol Chem，2002，277(29)： 26260-26267.

[30]Kannan M.p250 GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation[J].PLoS One，2012，7(11)： 50735.

[31]Wanke R.Role of podocyte damage in the pathogenesis of glomerulosclerosis and tubulointerstitial lesions： findings in the growth hormone transgenic mouse model of progressive nephropathy[J].Verh Dtsch Ges Pathol，2001，85： 250-256.

[32]Jaffe AB，Hall A.Rho GTPases： biochemistry and biology[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2005，21： 247-269.

[33]Asanuma K.Synaptopodin orchestrates actin organization and cell motility via regulation of RhoA signalling[J].Nat Cell Biol，2006，8(5)： 485-491.

[34]Blattner SM.Divergent functions of the Rho GTPases Rac1 and Cdc42 in podocyte injury[J].Kidney Int，2013，84(5)： 920-930.

Rho family and the regulation of podocyte cytoskeleton

HE Rong1，2，LI Gui-sen2

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)基金資助項目(編號：2012CB517604)

R692.6；R394.2

B

1672-6170(2015)03-0183-04

2015-01-24；

2015-03-11)

△通訊作者