siRNA沉默腎上腺髓質素基因對A375黑素瘤細胞表達VEGF IL－10的影響*

高陽，胡曉梅，楊寧，孫宇，梁官釗，韓晨珠，段昕所

(承德醫學院附屬醫院，河北承德067020)

siRNA沉默腎上腺髓質素基因對A375黑素瘤細胞表達VEGF IL－10的影響*

高陽，胡曉梅，楊寧，孫宇，梁官釗，韓晨珠，段昕所＊＊

(承德醫學院附屬醫院，河北承德067020)

目的:研究siRNA沉默腎上腺髓質素基因對A375黑素瘤細胞表達VEGF、IL－10的影響。方法:采用人黑素瘤細胞株A375，分為采用正常未轉染組細胞做為空白對照，人工合成的非特異序列轉染A375細胞為陰性對照，人工合成的腎上腺髓質素(ADM)靶向小分子干擾RNA轉染A375細胞為抑制ADM基因表達實驗組。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法和免疫細胞化學染色方法檢測各組細胞中VEGF、IL－10的表達水平。結果:空白對照組、陰性對照組、ADM siRNA轉染組ELISA法測定VEGF的表達量分別為192.246±17.330、187.831±14.450、96.218±10.078 pg/mL;IL－10的表達量分別為108.822±7.55、103.250±4.785、37.024±5.770pg/mL，組間比較差異均有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。免疫組化法測定顯示結果同ELISA結果。結論:siRNA沉默ADM基因可下調A375黑素瘤細胞免疫抑制分子VEGF、IL－10的表達。

小分子干擾;腎上腺髓質素;黑素瘤;血管內皮生長因子;白細胞介素－10

腎上腺髓質素(ADM)是在嗜鉻細胞瘤組織中發現的一種內源性血管活性肽，研究發現絕大多數的腫瘤細胞能夠產生ADM，并且在促進腫瘤生長的過程中發揮著腫瘤生長因子的作用。RNA干擾技術可以對基因進行沉默，目前研究已證實siRNA(small interference RAN，siRNA)沉默腎上腺髓質素基因能夠將A375黑素瘤細胞阻滯在G2/M期，抑制細胞增殖、促進凋亡，降低A375黑素瘤細胞的體外侵襲能力［1，2］。腫瘤細胞分泌免疫抑制分子抑制機體免疫功能，使腫瘤細胞逃避機體的免疫監視，是腫瘤得以發生、發展和轉移的重要機制。ADM基因的表達是否與免疫抑制分子介導的免疫逃逸有關值得進一步研究。

1 資料與方法

1.1 材料:黑色素瘤細胞系A375購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司;小干擾RNA(siRNA)、轉染試劑riboFECT TM CP Buffer(10×)、riboFECT TM CP Reagent購于廣州市銳博生物科技有限公司;VEGF一抗(鼠抗人)、IL－10一抗(兔抗人)、ADM一抗(鼠抗人)購于美國Santa Cruz公司;二抗(抗鼠、兔)購于北京中杉金橋生物技術有限公司;DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司;ELISA主要試劑人VEGF ELISA試劑盒、人IL－10 ELISA試劑盒購于深圳市達科為生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染:取對數生長的A375細胞，胰酶消化，以含10%FBS的1640培養液吹打，并制備成濃度為1×105/mL的細胞懸液，以每1000μL加入24孔板中，每組siRNA設三個復孔。待細胞融合至50%～60%，用50 nM的ADMsiRNA轉染A375細胞，siRNA序列參考李志加文獻［1］，將配制好的siRNA工作液以每孔1.25μL的量混勻，室溫孵育5min，每孔按照5μL riboFECT TM CP Reagent加入siRNA工作液配制成混合液，輕輕吹打混勻，室溫孵育0～15min，將混合液以每孔6.25μL加入到443.75μL細胞培養液中，陰性對照組轉染非特異序列，空白對照組加入500μL不含ADMsi－RNA的完全培養液，使每孔的終體積為500μL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中進行培養，作用24h。

1.2.2 免疫細胞化學染色方法檢測各組ADM、VEGF、IL－10蛋白的表達情況:細胞爬片固定后，所有切片染色均采用相同條件，按免疫組化步驟進行。結果判定以細胞內(胞漿、胞核、核膜)呈現棕黃色著色為陽性，不著色為陰性(～)。每組選三張片，每個細胞爬片隨機選擇5個高倍視野(10×40倍)，每個視野作為一例標本，以細胞質和(或)細胞膜中出現棕黃色顆粒為陽性，將陽性細胞占總細胞數的百分比和染色強度進行半定量處理。每個細胞爬片選擇5個具有代表性的高倍視野(×400倍)，計算陽性率，評價方法參照Birner等［3］的方法，＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度染色弱但強于陰性對照者為1分，染色清晰者為2分，染色強者為3分。上述兩項評分相加，＜3分為(－)，3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分(+++)最后計算兩種記分的和做為半定量分級。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組細胞培養上清中VEGF、IL－10的含量。按照所購試劑盒的步驟，采取雙抗體夾心ELISA法測定上清VEGF、IL－10的含量。

1.3 統計學處理:采用SPSS17.0統計學軟件對結果進行處理，免疫細胞化學染色結果采用卡方檢驗進行分析;計量資料數據以±s表示，采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫細胞化學染色方法檢測各組ADM、VEGF、IL －10蛋白的表達情況

圖1 各組細胞ADM的表達結果

圖2 各組細胞VEGF的表達結果

表1

圖3 各組細胞IL－10的表達結果

2.1.1 免疫細胞化學染色法檢測siRNA沉默效果:在轉染不同RNA序列(ADM序列、非特異序列)及未轉染的干預作用下，各組A375黑素瘤細胞連續培養24h，經免疫細胞化學染色法檢測結果，圖1中ADM-siRNA轉染組ADM的表達量明顯低于空白對照(χ2= 40.168，P＜0.01)和陰性對照組(χ2=40.168，P＜0.01)，差異具有統計學意義，而陰性對照和空白對照組ADM高表達，兩組間差異具有統計學意義(χ2=30.498，P＜0.01)。圖2中A375黑素瘤細胞可見VEGF陽性表達，陽性染色主要定位于胞漿、胞膜及胞核。ADMsiRNA轉染組VEGF的陽性信號較空白對照組(χ2=41.589，P＜0.01)及陰性對照組(χ2=41.589，P＜0.01)低，差異具有統計學意義，而空白對照組和陰性對照組陽性表達較高，兩組間差異有統計學意義(χ2=27.726，P ＜0.01)。

圖3中A375黑素瘤細胞可見IL－10陽性表達，陽性染色主要定位于胞漿、胞膜及胞核。ADMsiRNA轉染組IL－10的陽性信號較空白對照組(χ2=27.726，P＜0.01)及陰性對照組(χ2=30.498，P＜0.01)低，差異具有統計學意義，而空白對照組和陰性對照組陽性表達較高，兩組間差異有統計學意義(χ2=19.408，P＜0.01)。

2.1.2 免疫細胞化學染色方法檢測各組ADM、VEGF、IL－10蛋白的表達分級情況，見表1。

2.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組細胞培養上清中VEGF和IL－10的含量:在轉染不同RNA序列(ADM序列、非特異序列)及未轉染的干預作用下，各組A375黑素瘤細胞連續培養24h收集培養上清，ELISA法檢測，結果見表2。轉染ADMsiRNA后A375黑素瘤細胞表達VEGF的量顯著低于陰性對照組和空白對照組，差異有統計學意義(F=129.935，P＜0.01);兩兩比較，陰性對照組與空白對照組差異無顯著性(P ＞0.05)，ADMsiRNA轉染組與陰性對照組和空白對照組兩組分別比較均具有顯著性差異(P＜0.01)。

表2 各組上清液中VEGF和IL－10的含量(pg/mL，±s)

表2 各組上清液中VEGF和IL－10的含量(pg/mL，±s)

分組NVEGFIL－10空白對照組9192.246±17.329108.822±7.55陰性對照組9187.831±14.450 103.250±4.785 ADMsiRNA轉染組996.218±10.07837.024±5.770

3 討論

黑素瘤的形成過程存在著免疫逃逸機制，而腫瘤細胞主要通過分泌免疫抑制分子逃避機體免疫系統識別和攻擊，目前已確定的免疫抑制分子有20余種，其中與黑素瘤密切相關的免疫抑制分子有血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞介素－10(IL－10)和前列腺素E2 (PGE2)等。這些細胞因子通過自分泌－旁分泌等途徑參與細胞的轉型及逃避免疫監視，為腫瘤的發生及發展創造有利的微環境。新生血管的形成貫穿著腫瘤發生及發展的各個階段［4，5］，VEGF被認為是促進血管生成作用最強的細胞因子［6～8］，腫瘤細胞分泌的VEGF不僅能夠與血管內皮細胞表面的特異性受體結合，還能同時表達VEGF受體，這種共表達方式說明了VEGF可通過自分泌或旁分泌方式影響腫瘤的生物學行為，并且在一定程度上降低了機體免疫系統對腫瘤的排斥效應。IL－10是由免疫適應細胞及腫瘤細胞、上皮細胞等非免疫細胞產生，能夠抑制多種效應分子，抑制生物體的抗腫瘤免疫。本研究利用RNA干擾技術沉默ADM基因，采用的小干擾RNA(siRNA)序列是參照李志加的研究，由生物公司設計三對siRNA序列，實時熒光定量(qRT)－PCR檢測3對siRNA序列轉染A375細胞后細胞內靶基因mRNA表達，以檢測其轉染效果，三組干擾率分別為15%、76%、50%，轉染效果最佳的第二組其siRNA序列:正向鏈為5’－GCCAGAGCAUGAAC AACUUdTdT－3，反向鏈為3’－dT-dTCGGUCUCGUACUUGUUGA A－5’，干擾靶序列為GCCAGAGCATGAACAACTT，本實驗繼續采用此siRNA序列，轉染A375黑素瘤細胞沉默ADM基因，作用24h干擾ADM基因后利用免疫細胞化學染色及ELISA方法檢測。結果說明ADM基因表達下調可抑制A375黑素瘤細胞VEGF及IL－10的表達。郭雙華［9］通過對人腎癌786－O細胞研究發現加入100nM 的ADM后VEGF及ADM蛋白mRNA表達增高，而加入阻滯劑培養后，VEGF的表達受到抑制，說明ADM可能通過調節VEGF的表達來參與腎癌新生血管生成、進而促進腫瘤發展，本實驗也證實了這種調節機制，但是否是從轉錄水平影響mRNA表達，亦或是影響信號傳導途徑的某一關鍵因子還有待進一步研究。

IL－10基因啟動子區域存在著多態性，這與腫瘤的進展密切相關，有研究發現，IL－10－1082AA基因型與乳腺癌的進程相關，作用24h干擾ADM基因后利用免疫細胞化學染色及ELISA方法檢測發現IL－10的表達受到了抑制，說明免疫抑制分子IL－10的表達受到ADM基因的影響，前期的研究已證實siRNA沉默A375黑素瘤細胞ADM基因，抑制了細胞增殖，促進凋亡，將細胞阻滯在G2/M期，本實驗繼續深入研究基因干擾后其對腫瘤細胞表達免疫抑制分子的影響，通過細胞化學染色及ELISA法檢測siRNA沉默A375黑素瘤細胞ADM基因是否對VEGF及IL－10的表達有影響。

［1］李志加，孫立新，陸潔，等.siRNA沉默腎上腺髓質素基因對黑素瘤細胞增殖和凋亡的影響［J］.中華皮膚科雜志，2012，45(12):878～881.

［2］白秀會，曹娜，李娜，等.siRNA沉默腎上腺髓質素基因對A375黑素瘤細胞周期的影響［J］.臨床和實驗醫學雜志，2013，12(17):1345～1346，1349.

［3］Birner P，Schindl M，Obermair A，et al.Overexpression of hypoxia－inducible factor α is a marker for an unfavorable prognosis in early－stage invasive cervical cancer［J］.Cancer Res，2000，60(17):4693～4696

［4］Kim HN，Kim H，Kong JM，et al.Vitamin C down－regulates VEGF production in B16F10 murine melanoma cells via the suppression of p42/44MAPK activation［J］.Cell Biochem，2011，112(3):894～901.

［5］Lasagna N，Fantappiè O，Solazzo M.Hepatocyte growth factor and inducible nitric oxide synthase are involved in multidrug resistance－induced angiogenesis in hepatocellular carcinoma cell lines［J］.Cancer Res，2006，66(5):2673～2682.

［6］Tomoda M，Maehara Y，Kakeji Y，et al.Intratumoral neovascularization and growth pattern in early gastric carcinoma ［J］.Cancer，1999，85(11):2340～2346.

［7］畢鋒，劉娜，等.RhoGTPases對腫瘤血管生成相關分子的作用［J］.中國生物化學與分子生物學報，2004，20(5): 664～669.

［8］Xue Y，Bi F，LiuN，et al.Effect of Rho GTP ases on tumor angiogenesis related molecules［J］.Chin BiochemmoL Biol，2004，20(5):664～669.

［9］敦雙華，王東彬，喬娜，等.VEGF在腎癌細胞的表達及腎上腺髓質素對其的影響［J］.山東醫藥雜志，2012，52 (11):36～37.

Impact of Small Interference RNA－induced Silencing of Adrenomedullin Gene on the Expression of VEGF IL－10 in Malignant Melanoma Cells

GAO Yang，HU Xiaomei，YANG Ning，et al
(The Affiliated Hospital to Chengde Medical College，Hebei Chengde067000，China)

Objective:To assess the impact of small interference RNA－induced silencing of adrenomedullin gene on the expression of VEGF，IL－10 in malignant melanoma cells.Method:A375 cells were classified into 3 groups to be transfected with the selected siRNA(test group)，non－specific sequences (negative control group)，or remain untransfected(blank control group).Immunocytochemical staining and ELISA was performed to detect the expressions of VEGF and IL－10 in each group.Result:The expression of VEGF was 192.246±17.330 pg/mL in the control group，187.831±14.450 pg/mL in the negative control group and 96.218±10.078 pg/mL in ADMsiRNA transfected group.The expression of IL－10 was 108.822±7.55 pg/mL in the control group，103.250±4.785 pg/mL in the negative control group and 37.024±5.770 pg/ mL in ADMsiRNA transfected group.The differences were statistically significant.The results of immunohistochemistry are the same of ELISA.Conclusion:siRNA silencing adrenomedullin gene can inhibit the expression of VEGF and IL－10 in A375 melanoma cell.

small interfering;Adrenomedullin;Melanoma;VEGF;IL－10

B

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.07.013

1006－6233(2015)07－1096－04

河北省科技支撐計劃項目，(編號:09276101D－14)

＊＊通訊作者:Email:duanxinsuo2002@163.com