RP-HPLC同時測定復方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的含量

高磊 賈燕花 王曉青 劉皈陽

·藥物研究·

RP-HPLC同時測定復方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的含量

高磊 賈燕花 王曉青 劉皈陽

目的建立同時測定復方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定含量的反相高效液相色譜方法(RP-HPLc)。方法采用高效液相色譜法，C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相以甲醇為流動相A，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 3.5)(20∶80)為流動相B，采用梯度洗脫方法;檢測波長為280 nm。結果替硝唑和醋酸氯己定的含量分別在80.2～280.7 μg/ml、80.28～280.98 μg/ml的范圍內線性關系良好，平均回收率分別為100.08%和100.33%(n=6)。結論該方法操作簡便，結果可靠，可以用于同時測定復方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的含量，以控制該制劑的質量。

替硝唑;醋酸氯己定;高效液相色譜法;含量測定

復方替硝唑溶液臨床上用于口腔厭氧菌感染及其他細菌感染引起的咽峽炎、牙周炎及口腔潰瘍等，主要成分為替硝唑和醋酸氯己定等。該制劑質量標準中僅采用紫外分光光度法控制替硝唑的含量，未進行醋酸氯己定的含量控制。因此，參考相關文獻［1-12］，在保證測定結果的準確度和良好的檢測效率的前提下，筆者通過摸索實驗條件，建立了同時定量檢測復方替硝唑溶液中替硝唑和醋酸氯己定的反相高效液相色譜法(RP-HPLc)，以便提供安全、有效的藥品。

1 儀器與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀(1100，Agilent)，色譜柱(C18，Thermo Scientific)，pH計(pHS-3E，上海雷磁)，紫外分光光度計(UV-2450，日本島津)，電子天平(BT25S，賽多利斯)。

1.2 試藥替硝唑(100336-200703，中國食品藥品檢定研究院)，醋酸氯己定(100183-201003，中國食品藥品檢定研究院)，復方替硝唑溶液(20130724，130806A，第三軍醫大學第三附屬醫院;130814，中國人民解放軍總醫院第175醫院;1307371，上海長海醫院)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇為流動相A，甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH值3.5)(20∶80)為流動相B，流速為每分鐘1 ml，照下表進行梯度洗脫;檢測波長280 nm;進樣量為10 μl。

時間(min)流動相A(%)流動相B(%) 100 8 5545 155546 15.10100 0 0 200100

2.2 對照品溶液的配制替硝唑對照品溶液的配制:精密稱取替硝唑對照品適量，置于量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1毫升中約含替硝唑0.2 mg的溶液，作為替硝唑對照品溶液;醋酸氯己定對照品溶液的配制:精密稱取醋酸氯己定對照品質量，置于量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1毫升中約含醋酸氯己定0.2 mg的溶液，作為醋酸氯己定對照品溶液;混合對照品溶液制備:分別精密稱取替硝唑對照品和醋酸氯己定對照品各適量，置于同一容量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1毫升中約含替硝唑0.2 mg、醋酸氯己定0.2 mg的溶液，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制取供試品適量，濾過，即得。

2.4 陰性樣品溶液的配制按照處方比例，精密稱取20 mg甜葉菊苷置于50 ml量瓶中，加水溶液并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5 系統適用性實驗按“2.1”項下的色譜條件，精密量取替硝唑對照品溶液、醋酸氯己定對照品溶液、陰性樣品溶液各10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。主成分甲硝唑、酮康唑和丙酸氯倍他索的色譜峰分離度良好。見圖1。

2.6 線性關系考察精密稱取替硝唑對照品20 mg，醋酸氯己定對照品20 mg，置同一50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為線性儲備液;分別精密量取2、3、4、5、6、7 ml置10 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為線性供試液。精密量取上述供試液10 μl進樣，按照“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積的積分值為縱坐標(Y)，分別以替硝唑和醋酸氯己定濃度(μg/ml)為橫坐標(X)作標準曲線，計算其回歸方程。替硝唑:Y=7.16X+7.38，r= 0.9995;醋酸氯己定:Y=12.37X-9.23，r=0.9995。結果表明，替硝唑和醋酸氯己定分別在80～280 μg/ml、80～280 μg/ml的范圍內線性關系良好，符合規定。

圖1 替硝唑對照品(A)、供試品溶液(B)、醋酸氯己定對照品(C)、陰性樣品(D)色譜圖

2.7 精密度實驗精密量取混合對照品溶液10 μl，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，計算替硝唑和醋酸氯己定的吸收峰面積RSD值，分別為0.13%和0.04%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性實驗精密量取供試品溶液，在相同色譜條件下分別于0、6、12、24、48 h精密量取10 μl，記錄峰面積，計算替硝唑和醋酸氯己定的吸收峰面積RSD值，分別為0.06%和0.12%，結果表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.9 重復性實驗取批號為130814的復方替硝唑，按照“2.3”項下的方法制備6份供試品溶液，并按照“2.1”項下的色譜方法平行測定，替硝唑和醋酸氯己定含量的RSD值分別為0.09%和0.53%(n=6)，結果表明該方法重復性良好。

2.10 準確度實驗分別精密稱取替硝唑對照品適量(相當于替硝唑16 mg、20 mg、24 mg，相當于醋酸氯己定16 mg、20 mg、24 mg)，置于100 ml量瓶中，按照處方比例加入輔料，加水溶液并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為80%、100%、120%的供試品溶液，每種濃度制備3份，按“2.1”項下的色譜條件進樣，測定峰面積，按照外標法計算各水平的回收率。替硝唑的平均回收率為100.08%，RSD值為0.79%;醋酸氯己定的平均回收率為100.33%，RSD值為1.07%。

2.11 樣品測定按照上述色譜條件，分別精密量取供試品溶液和對照品溶液各10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按照外標法以峰面積計算樣品的含量。見表2。

表1 樣品含量測定結果%

3 討論

替硝唑在317 nm處有較強吸收;醋酸氯己定在255 nm處有較強吸收;空白輔料在280 nm處無吸收。故選擇280 nm作為本品的檢測波長。

供試品經濾過后直接進樣，響應值符合高效液相色譜法含量測定的要求，該供試品制備方法簡便，易于常規操作。同時，由于該制劑主要溶劑為水，因此首選水作為對照品溶液制備的溶劑，并獲得良好的峰形。

《中華人民共和國藥典》2010年版二部中的替硝唑原料藥［13］和醋酸氯己定原料藥［13］采用容量分析方法，筆者嘗試建立了同時測定替硝唑和醋酸氯己定的高效液相色譜方法，該方法具有良好的專屬性、精密性和準確性，以及良好的分離效能，為復方氯倍他索乳膏的質量控制提供了可靠的依據。

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A

1002-7386(2015)02-0290-02

2014-09-11)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．051

100048北京市，中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院藥劑藥理科

劉皈陽，100048中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院藥劑藥理科; E-mail:liuguiy@live.cn