運用SRAP分子標記對胡麻雜交種純度的鑒定研究

李聞娟 齊燕妮 王利民 黨照 趙瑋 張建平

摘要：以胡麻雜交種隴雜1號、隴雜2號及其父母本自交系為試材，從9對引物中篩選出2對M10/E3和M2/E5分別進行SRAP分析。結果表明，在隴雜1號母本1S和父本873中均能擴增出至少1條特征帶。隴雜1號與父母本相比均有差異帶，隴雜2號中產生雙親互補帶型。這2對引物均可應用于隴雜1號和隴雜2號的純度鑒定。

關鍵詞：胡麻;雜交種;SRAP分子標記;純度鑒定

中圖分類號：S565.9 ? ? ? ? 文獻標志碼：A ? ? ? ? 文章編號：1001-1463（2019）09-0059-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.09.014

Abstract：PCR -DGGE cloning sequencing technology was used to analyze and compare the bacterial community structure，richness index and diversity index of soil bacteria in rice-rape rotation cultivation layer. Through the analysis of the DGGE profiles concluded that biogas slurry in successive years application does not favor the rich soil bacterial community diversity， when biogas slurry application of total amount controled in 339.31～396.81 t/hm2， bacterial community diversity increases， bacterial population feature rich， complicated information and population stable， too high or too low application of biogas slurry can significantly reduce the bacterial community diversity; According to UPGMA analysis， the genetic similarity of soil bacteria decreased after long-term continuous application of biogas slurry， and the bacterial population structure changed bigger and bigger.

Key words：Rice-rape rotation; Amount of biogas slurry; Bacterial community diversity; PCR-DGGE.

胡麻（Linum usitatissimum）是油用亞麻的俗稱，是中國北方重要的油料作物之一，屬于亞麻科亞麻屬[1 - 3 ]。目前，亞麻雜交種純度主要依靠田間種植鑒定法，但田間形態學觀察鑒定生長周期長，易受環境和人為因素的影響，結果往往不準確[4 ]。分子標記技術的發展為雜交種純度鑒定提供了新的方法。相關序列擴增多態性（SRAP，Sequence-related amplified polymorphism）是一種新型的基于PCR的分子標記技術，由Li等[5 ]提出，采用獨特的引物設計對開放閱讀框（open reading frames）進行擴增，由于不同物種間和個體間以及內含子、啟動子與間隔長度不等而產生多態性。與AFLP（擴增片段長度多態性）、SSR（簡單重復序列標記）、RAPD（隨機擴增多態性DNA標記）等分子標記相比，SRAP具有操作簡單，成本低等優點，已被廣泛的應用于植物遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析及品種鑒定等領域[6 ]。目前應用SRAP分子標記對胡麻雜交種進行 純度檢驗的報道較少。我們篩選出9對多態性好的SRAP引物對胡麻品種隴雜1號和隴雜2號以及父母本進行擴增，通過SRAP分子標記的鑒定，以提高胡麻雜交種純度檢測的準確性。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 供試材料

供試胡麻品種隴雜1號、隴雜2號及其父母本均由甘肅省農業科學院作物研究所胡麻課題組提供。

1.2 ? 引物和試劑

SRAP引物由北京金唯智生物技術有限公司合成（見表1），所用Mg2+、Taq酶、dNTPs和Buffer均購自天根生物技術有限公司。

1.3 ? 試驗方法

1.3.1 ? ?DNA的提取 ? ?胡麻基因組DNA提取采用改良CTAB法[7 ]。單株采摘亞麻幼嫩葉片提取DNA，然后進行DNA溶液濃度與純度檢測，稀釋為30 ng/μL，-20 ℃下保存。

1.3.2 ? ?SRAP-PCR擴增的反應條件 ? ?PCR擴增反應的總體積為25 μL：體系包含10×PCR Buffer 2 μL、25 mmol/L Mg2+ 2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 3 μL、2.5 U Taq 酶0.5 μL、30 ng/μL 模板DNA 2 μL 以及25 ng/μL 引物各1 μL，其余用ddH2O補足。

相應PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 S，34.5 ℃退火20 S，72 ℃延伸60 S，共5個循環;94 ℃變性45 S，50 ℃退火20 S，72 ℃延伸60 S，共38個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.3 ? ?擴增產物電泳 ? ?擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。每孔上樣量定為6.0 μL，電壓100 V（4 V/cm）電泳60 min，電極緩沖液為1×TBE。0.05% EB染色，紫外凝膠呈像系統下觀察、照相和分析。用100 bp DNA Marker作為分子量的標準。

2 ? 結果與分析

2.1 ? SRAP多態性分子標記分析

通過圖1可以看出，篩選出的9對引物分別在2個胡麻雜交種和父母本之間存在擴增條帶的多態性。M10/E7擴增的條帶數為11條，多態性比率為18%;M10/E3擴增條帶數為13條，多態性比率為31%;M1/E9擴增的條帶數為11條，多態性比率為18%;M4/E3擴增的條帶數為13條，多態性比率為46%;M3/E2擴增的條帶數為9條，多態性比率為33%;M3/E16擴增的條帶數為11條，多態性比率為18%;M2/E5擴增的條帶數為9條，多態性比率為67%;M6/E6擴增的條帶數為9條，多態性比率為33%;M3/E10擴增的條帶數為10條，多態性比率為40%;平均每個引物組合擴增的清晰條帶數為11條，多態性比率為34%。從這9對SRAP引物中篩選出2對引物M10/E3和M2/E5，在父母本擴增中出現差異條帶，在雜交種與其父母本擴增中均有差異條帶，且條帶清晰明亮，重復性高。可用于2個胡麻雜交種和其父母本之間擴增。

2.2 ? 引物篩選結果

用引物M10/E3對隴雜1號、隴雜2號及其父母本自交系的SRAP檢測結果（圖2）表明，在母本1S中擴增出1條特征帶，此特征帶能將母本與父本和雜交種區分開。父本873中擴增出2條特征帶，此特征帶能與雜交種區分開。雜交種隴雜1號與父母本相比都有差異帶。用引物M2/E5對隴雜1號、隴雜2號及其父母本自交系的SRAP檢測結果（圖3）表明，在母本1S中擴增出1條特征帶，在父本隴10中擴增出1條特征帶，在雜交種隴雜2號中產生雙親互補帶型。因此，這2對引物可應用于隴雜1號和隴雜2號的雜交種純度鑒定。

2.3 ? 純度鑒定

通過用引物M10/E3對隴雜1號20粒種子的SRAP電泳檢測結果（圖4）可以看出，隴雜1號與父母本均有特征帶。隴雜1號 F1代雜交種種子為20粒，其中樣品17、22、23、24均未檢測出特征帶，因此，雜交種純度為80%。用引物M2/E5對隴雜2號20粒種子的SRAP電泳檢測結果（圖5）可以看出，隴雜2號產生雙親互補帶型，F1代雜交種種子總數為20粒，其中有雙親互補帶型的有18個，與父本帶型相同的是9、11、24，雜交種純度為85.7%。SRAP鑒定結果與田間種植鑒定結果基本一致，說明運用SRAP分子標記檢測胡麻雜交種純度鑒定可行。

3 ? 小結與討論

從9對引物中篩選出2對M10/E3和M2/E5，分別對胡麻品種隴雜1號、隴雜2號及其父母本自交系進行SRAP分析。結果顯示，在母本1S和父本873中均能擴增出至少1條特征帶。雜交種隴雜1號與父母本相比均有差異帶，雜交種隴雜2號產生雙親互補帶型。這2對引物均可應用于隴雜1號和隴雜2號的雜交種純度鑒定。

分子標記技術已經越來越廣泛地被應用到種子純度鑒定中[8 ]，SRAP通過聚合酶鏈式反應，對基因的啟動子、外顯子和內含子進行擴增，與SSR、RFLP、RAPD、AFLP等分子標記技術相比有很大優勢[9 ]，但是在采集材料和提取DNA的時要注意避免交叉污染，才能保證檢測結果的準確性。

參考文獻：

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[4] 趙欣欣，趙曉東，王 ? 奇，等. ?利用SRAP標記快速檢測西瓜雜交種子純度[J]. ?新疆農業科學2017，54（9）：1621-1626.

[5] LI G，QUIROS C F. ?Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. ?Theor. Appl. Genet.，2001，103（3）：455-461.

[6] 石紫薇，梁 ? 妍，姜婷婷，等. ?正交設計優化青蒿SRAP-PCR 反應體系及引物篩選[J/OL]. ?分子植物育種，2019（6）：1-16[2019-08-26].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068. S.20190621.1045.002.html.

[7] KIDWELL K K，OSBORN T C. ?Simple plant DNA isolation procedures[M]// Beckman J S，Osborn T C（Eds.）. ?Plant genomes： Methods for genetic and physical mapping. Netherlands： Kluwer Academic Publishers，1992：1-13.

[8] 楊曉琴，祝水金. ?種子質量控制現狀與對策[J]. ?種子，2005，24（8）：99-100.

[9] 田筑萍，唐 ? 容，吳有祥，等. ?利用SSR指紋圖譜技術對雜交油菜種質鑒定的研究[J]. ?種子，2008，27（6）：69-71.

（本文責編：陳 ? ? 偉）