互花米草NHX1基因的cDNA全長克隆、序列信息及定量表達分析

徐璐??+尹海波??+張俠??+曹雪霖??+盧楠楠??+閆麗華??陳世華??郭善利

摘要：以鹽生植物互花米草（Spartina alterniflora）為試驗材料，利用RACE技術克隆到編碼Na+/H+逆向轉運蛋白的[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因的cDNA全長序列。利用生物信息學軟件及網站對獲得的基因核苷酸序列及編碼的蛋白質序列進行分析，結果發現該核苷酸序列長度為2 277 bp，開放閱讀框為1 623 bp，編碼540個氨基酸殘基，且該基因所編碼的蛋白質與植物的Na+/H+逆向轉運蛋白NHX1 同源，所以命名為[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因。同時氨基酸序列比對顯示，其與蘆葦（Phragmites australis NHX，BAD95562.1）、玉米（Zea mays NHX，XP_008653443.1）、水稻（Oryza sativa NHX，BAA83337.1）等的NHX親緣關系相近，同源相似性依次為94%、92%、91%。利用Qiagene Rotor Gene Q熒光實時定量PCR儀對不同時間鹽處理及ABA處理的互花米草材料進行熒光定量PCR檢測。結果發現，在鹽處理及ABA處理的不同處理時期，該基因的相對表達量都發生了明顯的變化，這表明該基因受到了鹽脅迫及ABA脅迫的誘導，由此可以看出[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因與植物的耐鹽性有著密切的關系。

關鍵詞：耐鹽性；互花米草；[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因；相對定量表達

中圖分類號： Q785；Q786文獻標志碼：

隨著土壤鹽堿化面積的不斷增加，植物面臨著越來越嚴峻的高鹽挑戰。土壤中高濃度的鹽分會給植物帶來生理干旱、離子毒害等多種危害，嚴重影響到植物的正常生長發育，從而抑制農作物的高產。對于大部分植物來說，高鹽脅迫對植物的危害主要是由高濃度的Na+積累所導致的。雖然不同植物的耐鹽機制存在差異，但是其基本策略都是保持胞內Na+的平衡[1]。其中，植物體內的液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白（vacuolar Na+/H+antiporter）在植物抗鹽堿的過程中起著至關重要的作用，它可以將細胞質中過多的Na）隸屬禾本科米草屬，是典型高度耐鹽的泌鹽鹽生植物。它起源于美洲大西洋沿岸和墨西哥灣，適宜生活于潮間帶，同時具有很好的耐淹、抗風浪能力。它體內也存在著一類Na+/H+逆向轉運蛋白，以此來減輕Na+毒害。因此，互花米草材料對于研究植物耐鹽機制是一個很好的選擇，但是目前我國關于互花米草作為耐鹽基因資源方面的研究并不多見。為了進一步了解互花米草抗鹽性的分子機制，本研究以互花米草為材料，克隆得到了互花米草Na+/H+逆向轉運蛋白基因[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]，利用生物信息學軟件及網站對獲得的基因核苷酸序列及編碼的蛋白質序列進行分析，利用Qiagene Rotor Gene Q熒光實時定量PCR儀對互花米草在NaCl及ABA不同處理時間條件下表達量的變化情況進行檢測，為的進一步開發利用提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

互花米草種子來源于山東萊州海濱，放置于4 ℃保存。取出保存的種子播種于耶土 ∶[KG-*3]黑土=1 ∶[KG-*3]1 的培養基質中，于25 ℃、光照16 h、黑暗8 h的溫室條件下進行培養，2周后選取長勢一致的植株移栽到小方盆中繼續培養至4～5葉齡。用于基因克隆的取材：用 600 mmol/L NaCL溶液澆灌幼苗 48 h；用于定量表達分析的取材：分別用600 mmol/L NaCl溶液和 100 μmol/L ABA溶液對幼苗進行澆灌和噴灑，處理時間為0（對照）、3、6、12、24、48 h，每個處理重復3次。所有取材均經液氮速凍后于-80 ℃保存。

大腸桿菌DH5α為實驗室保存；pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、dNTP Mix、DNA限制性內切酶均購自TaKaRa公司；BIOZOL RNA Kit購于BIOFLUX公司；Reverse Transcriptase試劑盒購于Promega公司；Kanamycin Sulfate購于Sigma公司；試驗中所用其他試劑大多為國產分析純，部分試劑是參照文獻[13]自行配制的，所有引物的合成均由北京華大六合基因公司合成。

1.2試驗方法

反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s；40個循環），并分析試驗結果。

1.3數據分析

數據采用Origin 8.0進行處理，利用SPSS 19.0進行統計分析，差異顯著性水平α=0.05。

2結果與分析

2.1互花米草的克隆及序列分析

根據實驗室互花米草轉錄組測序結果及Blast比對分析設計特異引物，分別進行5′RACE及3′RACE（圖1），根據測序結果進行比對拼接獲得[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因全長序列信息（圖2）。

基因全長序列為2 277 bp，開放閱讀框（ORF）為1 623 bp，編碼540個氨基酸殘基（圖2）。ExPASy 在線程序預測其編碼的蛋白質分子質量為 59.4 ku，等電點為8.89。經TMHMM在線程序分析得SaNHX1蛋白是一個典型的跨膜轉運蛋白，預測其含有11個跨膜結構域（圖3），這一結果與之前的報道[4，14]是一致的。將克隆到的基因序列在NCBI網站上進行Blast比對，結果發現，其與蘆葦、玉米、水稻等的Na+/H+逆向轉運蛋白NHX親緣關系相近，相似性依次為94%、92%、91%。取高度相似（相似度>70%）的部分同源序列，使用Clustal X軟件進行同源序列比對，結果發現NHX1 蛋白序列具有高度保守區，且在 SaNHX1 蛋白上含有NHX抑制劑氨氯吡嗪脒結合位點 [15]及糖基化位點（圖4）。從構建的NJ系統進化樹（圖5）上可以看到NHX主要分為兩大類，一類是定位于液泡膜上的蛋白，如AtNHX1、AtNHX2等；另一類是定位于質膜上的蛋白，如AtNHX5、AtNHX6，其中SaNHX1蛋白歸屬于液泡膜蛋白。同時定位到液泡膜上的蛋白又分為單子葉與雙子葉兩類，這說明單子葉植物和雙子葉植物的NHX在進化上存在差異[16]，其中SaNHX1蛋白與單子葉植物的NHX蛋白親緣關系較近。[FL）]

3結論與討論

隨著土壤鹽漬化的加重，Na+/H+逆向轉運蛋白對于植物抵抗外界鹽漬環境具有非常重要的意義。本試驗從鹽生植物互花米草中克隆得到了編碼液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白的基因，對其編碼的蛋白質預測結果顯示，SaNHX1具有典型的跨膜結構域，且跨膜區數目與之前的報道一致，同時該蛋白上還存在NHX抑制劑氨氯吡嗪脒結合位點及糖基化位點，這些都是NHX的重要特性。系統進化分析表明，SaNHX1屬于液泡膜型NHX，而且與單子葉植物聚為一類，這表明單子葉植物與雙子葉植物NHX在進化上可能存在著一為進一步探討互花米草的耐鹽機制，本研究利用熒光實時定量PCR儀對互花米草在NaCl 及ABA不同脅迫時間條件下，其[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]表達量進行分析。研究結果顯示，無論是在鹽脅迫下，還是在ABA脅迫下，[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的表達量都發生了定的差異。

[CM（24]很大的變化，這說明在這2種脅迫下

目前，隨著土壤鹽漬化問題地日益加重，依靠分子生物學手段來克隆相關耐鹽基因[17-18]，并將其轉移到非抗鹽的作物中，以培育出耐鹽的轉基因新品種顯得尤為重要，這不僅可以在一定程度上開發利用鹽堿土地，而且對于提高農作物的產量具有非常重要的意義。目前關于[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的過量表達試驗正在進行中。

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