香稻不育系ISSR正交體系優化及驗證

徐君+劉鳳軍+張國芹+徐瑤+謝裕林+陳培峰+王建平+喬中英+黃萌+朱勇良

摘要：利用正交試驗設計，從Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物5種因素的4個水平對香稻不育系的ISSR-PCR反應體系進行優化，確立適合香稻的ISSR-PCR反應體系：1.0 U Taq酶、2.5 mmol/L Mg2+、40 ng模板DNA、0.25 mmol/L dNTP、0.1 μmol/L引物濃度。進一步驗證試驗表明，在該體系下將篩選的13個ISSR引物對15個香稻不育系進行PCR擴增，均可獲得穩定、清晰的條帶。

關鍵詞：香稻;ISSR-PCR;正交優化

中圖分類號： S511.03 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0021-03

收稿日期：2014-05-28

基金項目：江蘇省自然科學基金（編號：BK2010207）;江蘇省蘇州市應用基礎項目（編號：YJG0902）。

作者簡介：徐 君（1982—），男，江蘇蘇州人，碩士，助理研究員，研究方向為植物細胞工程。Tel：（0512）65386213;E-mail：flyforever007@163.com。

通信作者：朱勇良，副研究員，研究方向為水稻遺傳育種和生態安全標準化栽培。Tel：（0512）65386213;E-mail：thszyl@126.com。

ISSR（inter-simple sequence repeats）標記技術，是基于PCR（polymerase chain reaction）技術的DNA分子標記技術，采用17～22堿基的重復錨定引物擴增重復序列之間的片段，具有重復性較好、穩定程度高、多態性豐富等優點，已被廣泛應用于品種鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳作圖等研究[1]。利用ISSR標記對水稻進行遺傳分析及分類研究已有不少報道，如研究栽培稻與野生稻的親緣關系[2]、分析中國疣粒野生稻的遺傳多樣性[3]、對水稻光溫敏核不育系進行分子鑒定和遺傳分析[4]等。

江蘇太湖地區農業科學研究所從事水稻育種和相關工作已有多年，在太湖地區稻資源的收集、保存、種質鑒定及品質改良方面進行了較多的研究和摸索工作，目前收集有各類水稻資源超過2 000份。對資源的鑒定是資源利用的基礎，對所收集水稻資源的遺傳多樣性進行客觀評價，可以為遺傳多樣性的保護、品種鑒定及提高育種效率提供科學依據[5]。水稻的分子標記，現階段以SSR（simple sequence repeats）標記為主[6-7]，但是關于更為經濟、簡便的ISSR報道相對較少。穩定的擴增體系是ISSR結果應用于遺傳分析的前提[8]，由于ISSR-PCR反應條件易受多種因素干擾，簡單的單因素不能滿足體系建立要求。本研究采用正交試驗設計，從Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物5種因素的4個水平出發，對香稻不育系ISSR反應體系進行優化分析，以期為今后進一步將該技術應用于水稻育種輔助工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料是選自江蘇太湖地區農業科學研究所近期選育和引進的有代表性的15個香稻不育系材料：蘇香粳1號A、太湖粳6號A、吳江3號A、9703A、軟玉A、蘇04-799A、95122A、06A、運糯6028A、揚粳9538A、皖稻68A、蘇香粳1號A（紅蓮型）、吳江3號A（紅蓮型）、太湖粳6號A（紅蓮型）、9703A（紅蓮型）。

試驗所采購的所有試劑包括：DNA Marker、PCR試劑盒、電泳相關試劑，全部購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

本試驗所用ISSR引物是參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）所設計的引物序列，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻基因組DNA提取 取0.1 g左右水稻的葉片，直接放入離心管中，置于-70 ℃備用。

基因組DNA的提取采用改良的CTAB法[9]，用1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測DNA質量，并通過紫外-可見分光光度計測定D260 nm、D280 nm，檢測DNA的質量和濃度。將提取原液放置于-20 ℃保存。用于PCR反應的DNA工作液進一步稀釋至100n g/μL，備用。

1.2.2 正交優化ISSR-PCR反應 采用L16（45）正交設計表，由Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物5種因素各4個水平組成，共計16個處理，正交試驗設計見表1。以水稻不育系吳江3號A（紅蓮型）DNA為模板，用ISSR引物UBC835[5′-（AC）8YT-3′]進行試驗。各處理總體積為25 μL，每個處理中均加入2.5 μL無Mg2+的10×Taq buffer，不足的體積用超純水補足，詳見表2。

PCR擴增的程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環;72 ℃延伸 5 min;4 ℃終止反應。

將PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后于UV凝膠成像系統中觀察結果。

1.2.3 ISSR引物及優化體系驗證 根據錢韋等的報道[3-4]，篩選13個ISSR引物，對15個香稻不育系進行擴增，驗證所篩選引物對不育系的通用性及ISSR-PCR擴增體系的穩定性。

表1 ISSR-PCR正交試驗設計表L16（45）

處理編號 Taq酶

（U） Mg2+

（mmol/L） 模板DNA

（ng） dNTPs

（mmol/L） 引物

（μmol/L）

1 0.75（1） 1.5（1） 20（1） 0.10（1） 1.0（1）

2 0.75（1） 2.0（2） 40（2） 0.15（2） 1.5（2）

3 0.75（1） 2.5（3） 60（3） 0.20（3） 2.0（3）

4 0.75（1） 3.0（4） 80（4） 0.25（4） 2.5（4）

5 1.00（2） 1.5（1） 40（2） 0.20（3） 2.5（4）

6 1.00（2） 2.0（2） 20（1） 0.25（4） 2.0（3）

7 1.00（2） 2.5（3） 80（4） 0.10（1） 1.5（2）

8 1.00（2） 3.0（4） 60（3） 0.15（2） 1.0（1）

9 1.50（3） 1.5（1） 60（3） 0.25（4） 1.5（2）

10 1.50（3） 2.0（2） 80（4） 0.20（3） 1.0（1）

11 1.50（3） 2.5（3） 20（1） 0.15（2） 2.5（4）

12 1.50（3） 3.0（4） 40（2） 0.10（1） 2.0（3）

13 2.00（4） 1.5（1） 80（4） 0.15（2） 2.0（3）

14 2.00（4） 2.0（2） 60（3） 0.10（1） 2.5（4）

15 2.00（4） 2.5（3） 40（2） 0.25（4） 1.0（1）

16 2.00（4） 3.0（4） 20（1） 0.20（3） 1.5（2）

注：括號中數字表示水平。

表2 25 μL ISSR-PCR優化體系

試劑成分 25 μL體系

終濃度/用量 加入量

（μL）

10×Taq buffer 1× 2.5

25 mmol/L Mg2+ 2.5 mmol/L 2.5

2.5 mmol/L dNTP 0.25 mmol/L 2.5

25 μmol/L Primer 1.0 μmol/L 1.0

5 U/μL Taq Polymase 1 U 0.2

25 ng/μL模板DNA 40 ng 1.0

滅菌 ddH2O 14.3

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測

檢測同一批提取的DNA樣品結果表明，主帶明亮，略有拖尾現象。說明CTAB法快速提取DNA效果良好，但存在DNA降解現象;后續試驗表明，該法提取基因組DNA可滿足PCR試驗需求。

2.2 正交優化ISSR-PCR反應

依據瓊脂糖電泳條帶的強弱和雜帶的多少做直觀分析。從圖1可以看出，在16個處理組合中，由于Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物濃度5種影響因素組合的不同，擴增效果存在著明顯差異。按照擴增結果將16個處理從高到低依次打分，條帶數量豐富、背景清晰的記為16分;與之相反，擴增結果最差的為1分。編號1-16的評分結果分別為9、8、11、10、15、14、7、6、12、13、4、3、1、2、16、5分。圖2直觀分析結果顯示，Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物濃度的最佳條件組合分別為1.0 U、2.5 mmol/L、40 ng、0.25 mmol/L、0.1 μmol/L。

2.3 ISSR引物的篩選及體系驗證

以吳江3號A基因組DNA為模板，根據文獻報道選擇13個適用于水稻的ISSR引物（引物編號、序列見表3），利用這13個引物對供試的15個香稻不育系材料進行PCR 擴增，

結果如圖3所示?？梢钥闯觯?5份材料均可擴增出穩定、清晰的條帶。試驗共擴增出89條DNA條帶，條帶大小為 160～1 600 bp，其中引物UBC809擴增出的清晰條帶最多，為12條;引物UBC807、UBC855、UBC888的擴增條帶數最少，僅有5條?？傮w看出，13個引物共產生25條多態性帶，引物擴增產物的多態性比率較低，僅為28.1%。

表3 所篩選的ISSR引物序列及擴增帶數

引物編號 引物序列 擴增帶數

（條）

UBC807 5′-（AG）8T-3′ 5

UBC808 5′-（AG）8C-3′ 7

UBC809 5′-（AG）8G-3′ 12

UBC811 5′-（GA）8C-3′ 8

UBC 835 5′-（AG）8YC-3′ 7

UBC 855 5′-（AC）8YT-3′ 5

UBC 857 5′-（AC）8YG-3′ 7

UBC 864 5′-（ATG）6-3′ 8

UBC 880 5′-GGAGAGGAGAGGAGA-3′ 7

UBC 888 5′-BDB（AC）7-3′ 5

UBC 889 5′-DBD（CA）7-3′ 6

UBC 890 5′-VHV（GT）7-3′ 6

UBC 891 5′-HVH（GT）7-3′ 6

注：Y=（C，T），B=（C，G，T），D=（A，G，T），H=（A，C，T），V=（A，C，G）。

3 結論與討論

ISSR標記基于PCR技術，較RAPD、RFLP等第一代標記穩定，但也受多種因素影響，試驗的可靠性和穩定性與PCR反應條件有很大關系[10]。本試驗的目的在于建立1套成本低廉、操作簡便、可靠性高、表達穩定的ISSR-PCR技術體系，

以期提供大量遺傳信息，應用于香稻種質資源的鑒定。研究中發現，不同反應體系下ISSR-PCR反應結果可能出現不同（帶型不同），該情況在李雪等的研究中也有出現[8，11]，分析其原因，可能是由于部分處理的引物濃度或Taq酶濃度過高而引起非特異擴增。非特異帶的形成對研究結果會造成根本性誤差，因此建立穩定的ISSR-PCR反應體系并對體系進行驗證就顯得更為重要[10，12]。

本試驗利用正交設計優化，確定適用于香稻ISSR-PCR的體系為：1.0 U Taq酶，2.5 mmol/L Mg2+，40 ng模板DNA，0.25 mmol/L dNTP，引濃度0.1 μmol/L。在該體系下將所篩選13個ISSR-PCR引物對15個不育系材料進行驗證擴增，結果表明，該體系廣泛適用于各材料及所篩選的引物，且表達穩定、條帶清晰。一般而言，13個ISSR引物擴增所獲得的信息足以進行相關遺傳分析，但筆者在試驗中發現，所篩選的13個引物雖然擴增出較多數目的分子標記（89個），但標記總體多態性較低，僅為28.1%，分析原因可能是由于香稻不育系之間來源類似、親緣關系較近。本試驗結果如果要分析香稻不育系間的遺傳關系，多態性標記數目顯得不足?？稍诒驹囼灮A上對香稻進行遺傳分析，進一步篩選適宜的ISSR引物以獲得更多的多態性標記，或采用分子標記結合表型標記的方法，以獲得理想的結果。

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