紫杉醇提取方法和曼地亞紅豆杉HPLC指紋圖譜的研究

李乃偉+束曉春+彭峰

摘要：為考察不同提取方法和HPLC檢測方法對紫杉醇HPLC檢測圖譜的影響，采用4種不同提取方法對曼地亞紅豆杉枝葉中的紫杉醇進行粗提，并通過3種不同的HPLC檢測方法對粗提物進行了檢測。通過HPLC檢測圖譜的比較，確立了曼地亞紅豆杉枝葉中紫杉醇的粗提方法和HPLC檢測方法。色譜條件：色譜柱為Curosil-PFP分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;檢測波長為227 nm;流動相為乙腈-水溶液梯度洗脫;流速2.6 mL/min;分析時間70 min;柱溫為30 ℃。

關鍵詞：紫杉醇;提取方法;HPLC檢測;曼地亞紅豆杉

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0296-03

收稿日期：2014-05-11

基金項目：江蘇省農業科技自主創新基金[編號：CX（12）2014]。

作者簡介：李乃偉（1983—），男，山東聊城人，碩士，助理研究員，主要從事生物技術研究。E-mail：linaiwei8828@163.com。

紫杉醇是紅豆杉屬（Taxus）植物特有的藥物成分，在植物體中含量很低，并與多種類似物共存，而且提取時常帶有很多色素、樹膠等雜質。得率高、重復性好的提取方法和高效液相色譜（HPLC）檢測方法，是進行紫杉醇含量調控研究的首要條件。目前，已有很多關于紫杉醇提取純化的報道[1-4]，然而，這些方法適用于檢測純度較高的紫杉醇成品和半成品，在產業化生產中應用時存在一定缺陷。國內紫杉醇提取往往采用粗提方法，而不采用成本太高的工藝程序。筆者比較了不同提取方法和不同色譜條件對紫杉醇粗提液HPLC檢測的影響，以期篩選一種簡便提取、精確檢測紫杉醇的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為江蘇省中科院植物所（南京中山植物園）實驗苗圃內引種栽培的曼地亞紅豆杉。11月取樣，采取當年生枝條，置于40 ℃烘箱7 d。烘干后粉碎，置于干燥器中密閉保存。

1.2 藥品與試劑

紫杉醇提取所用試劑均為分析純，HPLC檢測所用紫杉醇對照品購自安徽爾塔醫藥科技有限公司。標準品用甲醇溶解，配成濃度為0.12 mg/mL的溶液。

1.3 提取方法

采用4種不同方法提取樣品材料中的紫杉醇。 （1）精確稱取樣品5 g，甲醇回流（70 ℃）提取3次：第1次，100 mL甲醇，2 h;第2次，50 mL甲醇，1 h;第3次，50 mL甲醇，1 h。將浸提掖濃縮至100 mL后，加等體積正己烷，萃取4次，每次100 mL，然后，取甲醇相濃縮定容至25 mL。 （2）提取過程同方法（1），在正己烷萃取除雜后進行C18過柱處理，進一步除雜。 （3）提取過程同方法（1），用水代替甲醇浸提，回流溫度為100 ℃，用三氯甲烷代替正己烷進行萃取。 （4）提取過程同方法（3），在三氯甲烷萃取除雜后進行C18過柱處理，進一步除雜。

1.4 紫杉醇HPLC檢測條件

采用以下3種方法對紫杉醇粗提液進行HPLC檢測的比較。 （1）參照王文芝的HPLC方法[5]改進。采用Agilent-1100高效液相色譜儀，DAD監測器，檢測波長為228 nm。選用Kromasil ODS-C18分析柱（250×4.6 mm，5 μm），柱溫 30 ℃，流速0.8 mL/min，流動相梯度條件：乙腈 ∶ 水（0.4%磷酸液，pH值3.5）為48 ∶ 52。 （2）完全參照美國藥典中的HPLC方法[6]。采用Agilent-1100高效液相色譜儀，DAD監測器，檢測波長為227 nm。選用五氟苯基Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速 2.6 mL/min。流動相梯度條件，梯度洗脫：0～35 min保持乙腈-水（體積比35 ∶ 65）;35～60 min乙腈從35%升至80%，水從65%降至20%;60～70 min乙腈從80%降回35%，水從20%升回65%;70～80 min，保持乙腈-水（體積比35 ∶ 65）。 （3）參照美國藥典的HPLC方法進行改進，采用Agilent-1100高效液相色譜儀，DAD監測器，檢測波長為227 nm。選用Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm）;柱溫30 ℃;流速2.6 mL/min。流動相梯度條件：0～35 min保持乙腈-水（體積比30 ∶ 70）;35～60 min乙腈從30%升至50%，水從70%降至50%;60～61 min乙腈從50%降回30%，水從50%升回70%;61～70 min，保持乙腈-水（體積比30 ∶ 70）。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法對紫杉醇HPLC檢測的影響

采用王文芝的HPLC改進方法，對不同方法提取的紫杉醇粗提液進行檢測。圖1至圖4為不同方法的紫杉醇粗提樣品HPLC圖譜。從各圖譜中紫杉醇峰面積的大小可以看出，通過甲醇/正己烷萃取的紫杉醇得率（圖2、圖3）明顯高于氯仿/水（圖4、圖5）提取得率。過柱除雜（圖3、圖5）與未過柱（圖2、圖4）的紫杉醇提取方法，對HPLC檢測結果影響并不顯著。

2.2 不同檢測方法對紫杉醇HPLC檢測的影響

對通過正己烷/水萃取的未過柱紫杉醇粗提樣品，進行3

種不同條件的HPLC檢測。圖6至圖11顯示了不同檢測方法對樣品分離與峰形的影響。3種方法中，參照王文芝的HPLC方法進行改進的HPLC檢測圖譜（圖7），各樣品分離效果最差。參考美國藥典的HPLC檢測圖譜（圖8、圖9），各樣品分離度高，但進樣速度過大，柱壓太高對分析柱損傷很大。改進后的美國藥典HPLC檢測方法，流速降低，柱壓減小，檢測圖譜（圖10、圖11）顯示，雖然出峰時間延遲，但峰形及分endprint

離度未受影響。采用C18分析柱檢測的紫杉醇峰面積大于采用五氟苯基Curosil-PFP分析柱檢測的峰面積（即美國藥典HPLC方法及其改進方法），但是前者圖譜（圖7）的紫杉醇臨近峰數量少于后者（圖11）。推測原因是，采用C18分析柱檢測的方法分離度低，檢測出的紫杉醇峰可能為重疊峰，該色譜條件下無法分開一些與紫杉醇結構相似的化合物。而五氟苯基分析柱及梯度洗脫，可以將化合物結構相近的重疊峰分開。

3 結論

通過對不同提取方法與檢測方法的比較，篩選出曼地亞紅豆杉枝葉粗提紫杉醇的方法為：甲醇回流（70 ℃）提取3次：第1次，100 mL甲醇，2 h;第2次，50 mL甲醇，1 h;第3次，50 mL甲醇，1 h。將浸提液濃縮至100 mL后，加等體積正己烷，萃取4次，每次100 mL，然后，取甲醇相濃縮定容至 25 mL。色譜條件為：采用Agilent-1100高效液相色譜儀，DAD監測器。選用五氟苯基Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm）;柱溫30 ℃;流速2.6 mL/min;檢測波長為227 nm。0～35 min保持乙腈-水（體積比30 ∶ 70）;35～ 60 min 乙腈從30%升至50%，水從70%降至50%;60～ 61 min 乙腈從50%降回30%，水從50%升回70%;61～ 70 min，保持乙腈-水（體積比30 ∶ 70）。該提取方法和檢測條件可以用在栽培紅豆杉紫杉醇的含量調控研究中。

參考文獻：

[1]閻家麒，范金城，王九一. 紫杉醇提取純化工藝[J]. 中國醫藥工業雜志，1996，27（12）：531-534.

[2]張志強，田桂蓮，馮小黎，等. 從紅豆杉樹皮浸膏中提取紫杉醇初分離工藝的研究[J]. 中國生化藥物雜志，1999，20（2）：58-61.

[3]李春斌，佟憬憬，范圣第. 東北紅豆杉紫杉醇的提取純化與HPLC檢測[J]. 大連民族學院學報，2005，7（5）：22-25.

[4]喬亮杰，滿瑞林，倪網東，等. 曼地亞紅豆杉枝條中紫杉醇的提取純化研究[J]. 中國中藥雜志，2009，34（8）：973-976.

[5]王文芝. 西藏紅豆杉中紫杉醇及相關紫杉烷含量的高效液相色譜分析[J]. 色譜，1997，15（3）：76-78.

[6]The United States Pharmacopeial Convention Inc. United States pharmacopeia/national formulary：USP28-NF23[M]. Philadelphia，USA：National Publishing，2005：1456-1457.endprint