基于產(chǎn)品質(zhì)量分析的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝的優(yōu)化

劉金濤+范里+鄧獻(xiàn)存+劉旭平+譚文松

摘要：在前期建立的流加培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)上，考察培養(yǎng)過(guò)程中的pH值對(duì)流加培養(yǎng)過(guò)程的影響，明確了過(guò)程控制參數(shù)pH值與產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）間的聯(lián)系，建立了產(chǎn)物質(zhì)量屬性和過(guò)程操作屬性間的關(guān)系，并確認(rèn)pH值為抗體融合蛋白生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵控制參數(shù)。結(jié)果表明，流加培養(yǎng)過(guò)程隨著培養(yǎng)pH值的提高，抗體融合蛋白的生物學(xué)活性呈一定程度的下降趨勢(shì)，但唾液酸含量卻呈明顯的上升趨勢(shì);此外，在pH值6.9和pH值7.0的條件下培養(yǎng)過(guò)程中的最大細(xì)胞密度、活力、蛋白表達(dá)量均優(yōu)于其他條件，確定6.95±0.05為過(guò)程的控制pH值。將此培養(yǎng)工藝放到大200 L中試生產(chǎn)規(guī)模，結(jié)果與2 L反應(yīng)器的結(jié)果基本一致。

關(guān)鍵詞：CHO細(xì)胞;pH值;抗體融合蛋白;流加培養(yǎng);產(chǎn)品質(zhì)量

中圖分類(lèi)號(hào)： Q813.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0047-03

收稿日期：2014-12-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21106045）。

作者簡(jiǎn)介：劉金濤（1987—），男，山東臨沂人，博士研究生，主要從事動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究。E-mail：jtliu0416@gmail.com。

通信作者：譚文松，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究。E-mail：wstan@ecust.edu.cn。

抗體藥物由于具有靶點(diǎn)明確、臨床療效顯著、副作用少等優(yōu)點(diǎn)已成為當(dāng)今生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主流，其中動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是生產(chǎn)抗體藥物最主要的技術(shù)手段?！百|(zhì)量可控，安全有效”是藥品研發(fā)過(guò)程中應(yīng)首要遵循的原則，美國(guó)FDA在21世紀(jì)現(xiàn)行優(yōu)良生產(chǎn)規(guī)范（current good manufacturing practices，cGMPs）中提出的一個(gè)關(guān)鍵要素就是質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）[1]。因此在工藝開(kāi)發(fā)中始終貫徹QbD原理，設(shè)計(jì)不同的參數(shù)控制范圍來(lái)設(shè)計(jì)產(chǎn)品的質(zhì)量，使得產(chǎn)品質(zhì)量始終處于可控狀態(tài)，對(duì)加快藥品開(kāi)發(fā)有著十分重要的意義[2]。

前期我們關(guān)于培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)影響及機(jī)制進(jìn)行了深入的研究和探討[3-4]，而培養(yǎng)過(guò)程中的另一關(guān)鍵控制參數(shù)——pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和表達(dá)有著重要作用[5]。一方面由于pH值在搖瓶、孔板等小規(guī)模培養(yǎng)高通量系統(tǒng)中難以進(jìn)行有效的檢測(cè)和控制，導(dǎo)致在放大到反應(yīng)器規(guī)模時(shí)則會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量不可控制的狀態(tài);另一方面細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中乳酸等代謝副產(chǎn)物的大量生成導(dǎo)致培養(yǎng)體系中的pH值發(fā)生較大變化，須要通過(guò)補(bǔ)酸或補(bǔ)堿的方式維持pH值的穩(wěn)定。因此在反應(yīng)器中系統(tǒng)研究pH值對(duì)于細(xì)胞生理狀態(tài)特別是產(chǎn)物質(zhì)量的影響是保證生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)品質(zhì)量可控的一項(xiàng)必不可少的工作。

本研究以表達(dá)抗體的融合蛋白的重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞為研究對(duì)象，以抗體融合蛋白關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)為主要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和產(chǎn)物表達(dá)情況，在2 L生物反應(yīng)器中對(duì)流加培養(yǎng)過(guò)程中的操作參數(shù)pH值進(jìn)行了詳細(xì)的考察，通過(guò)綜合分析確定最適pH值，并成功地將該工藝穩(wěn)定地放大到中試生產(chǎn)規(guī)模。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和培養(yǎng)基

試驗(yàn)細(xì)胞株為表達(dá)抗體融合蛋白的重組CHO細(xì)胞。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為商業(yè)Excell 302培養(yǎng)基（SAFC），流加培養(yǎng)基為筆者實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā)[6]。培養(yǎng)基經(jīng)0.22 μm微孔濾膜（millipore）過(guò)濾除菌，保存于4 ℃冰箱。培養(yǎng)基配制所用試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇重組CHO細(xì)胞，以（2～3）×105 個(gè)/mL活細(xì)胞密度接種于搖瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為120 r/min，作為試驗(yàn)用的種子細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞，以約1.0×106 個(gè)/mL的活細(xì)胞密度接種至反應(yīng)器中，培養(yǎng)體積為1.5 L。培養(yǎng)過(guò)程中每24 h取樣，計(jì)數(shù)。培養(yǎng)液經(jīng)10 000 r/min離心10 min后取上清于-20 ℃保存，用于試驗(yàn)結(jié)束后營(yíng)養(yǎng)物、代謝副產(chǎn)物、抗體融合蛋白的檢測(cè)。培養(yǎng)過(guò)程均使用Sartorius公司生產(chǎn)的2 L BIOSTAT A-plus 細(xì)胞反應(yīng)器。培養(yǎng)時(shí)反應(yīng)器操作條件：溶解氧為50%，溫度為 37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min，pH值分別控制在6.8、6.9、70、7.2條件下（無(wú)控制作用區(qū)設(shè)為±0.02）。pH值的控制采用深層通入CO2或者補(bǔ)入1 mol/L NaOH 溶液的方式。流加策略采用葡萄糖控制模型[6]。

1.3 分析方法

細(xì)胞密度和活力采用Bio-Rad TC20TM 自動(dòng)計(jì)數(shù)儀，葡萄糖、乳酸、氨的檢測(cè)采用 NOVA Bioprofile 400;產(chǎn)物濃度的檢測(cè)采用 Protein A-HPLC （Applied Biosystems）的方法，方法參照文獻(xiàn)[7]。上清收獲后采用rProtein A親和層析柱（GE Healthcare）純化并收集抗體。唾液酸含量根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2010年版3部）中唾液酸檢測(cè)方法測(cè)定。生物學(xué)活性的測(cè)定方法同文獻(xiàn)[8]。多聚體的檢測(cè)采用凝膠排阻色譜（SEC）的方法，色譜柱為T(mén)SK-Gel G3000 SWXL （4.6 mm×30 cm，Tosoh Bioscience），方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的影響

2.1.1 pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 通過(guò)在不同pH值培養(yǎng)條件（6.8、6.9、7.0、7.2）下的對(duì)比試驗(yàn)可知，在pH值6.8條件下，CHO細(xì)胞直接進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，快速生長(zhǎng)達(dá)到最高細(xì)胞密度 8.6×106 個(gè)/mL，隨后活細(xì)胞密度顯著降低（圖1）。pH值6.9 和pH值7.0的條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)情況與pH值6.8條件下類(lèi)似，但最高活細(xì)胞密度達(dá)到1.01×107 個(gè)/mL，并且至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞仍維持較高的活力（大于90%）。而在pH值7.2的條件下最高活細(xì)胞密度僅為5.8×106 個(gè)/mL，隨后活細(xì)胞密度和細(xì)胞活力快速下降，培養(yǎng)僅維持9 d，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)細(xì)胞活力僅為45.7%。

2.1.2 pH值對(duì)主要營(yíng)養(yǎng)物表達(dá)的影響 葡萄糖是細(xì)胞生長(zhǎng)代謝所需的重要碳源和能源物質(zhì)，為了維持培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，防止葡萄糖耗竭所引起的細(xì)胞代謝的變化[10]，流加策略采用葡萄糖控制模型。由表1可知，在細(xì)胞生長(zhǎng)階段（0～5 d）各培養(yǎng)過(guò)程的葡萄糖比消耗速率無(wú)明顯差異。而產(chǎn)物表達(dá)階段（6～12 d），pH值控制在7.2的培養(yǎng)過(guò)程葡萄糖的比消耗速率依然維持在一個(gè)較高的水平，為1.8 mmol/（109cells·d），是其他培養(yǎng)過(guò)程的3.3～3.8倍。

乳酸和氨是細(xì)胞代謝的2個(gè)主要副產(chǎn)物，在培養(yǎng)基中的大量累積會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的表達(dá)[11-12]。與其他培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)乳酸代謝轉(zhuǎn)變現(xiàn)象不同，pH值為7.2的培養(yǎng)過(guò)程乳酸仍一直處于生成狀態(tài)，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基中的乳

表1 流加培養(yǎng)過(guò)程中主要營(yíng)養(yǎng)物及代謝副產(chǎn)物比消耗（生成）速率

pH值

比消耗速率[mmol/（109cells·d）]

葡萄糖 乳酸 氮

0～5 d 6～12 d 0～5 d 6～12 d 0～5 d 6～12 d

6.8 -2.40 -0.54 1.75 -0.43 0.44 0.27

6.9 -2.25 -0.50 2.05 -0.24 0.42 0.12

7.0 -2.35 -0.47 1.98 -0.08 0.49 0.05

7.2 -2.31 -1.80 2.61 0.82 0.45 0.054

注：負(fù)值代表消費(fèi)。

酸濃度達(dá)到了44.8 mmol/L，是其他過(guò)程的1.48～3.33倍（圖2-A）。培養(yǎng)過(guò)程中乳酸的大量累積可能是導(dǎo)致pH值為7.2時(shí)培養(yǎng)過(guò)程活細(xì)胞密度和細(xì)胞活力快速下降的主要原因。與乳酸代謝相似，氨代謝也在培養(yǎng)至4 d出現(xiàn)了顯著的區(qū)別（圖2-B）。氨在pH值為6.9～7.2的培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行到4 d后累積速率顯著降低，以pH值為7.0的培養(yǎng)過(guò)程為例，氨比生成速率從0.49降低至0.05（表1），而pH值為6.8的培養(yǎng)過(guò)程氨依然大量累積，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)氨濃度達(dá)到 17.7 mmol/L。

2.2 pH值對(duì)抗體融合蛋白表達(dá)以及產(chǎn)品質(zhì)量的影響

2.2.1 pH值對(duì)抗體融合蛋白表達(dá)的影響 由表2可知，在pH 值7.2條件下，由于細(xì)胞生長(zhǎng)和維持不利，抗體融合蛋白的最高濃度僅為0.32 g/L，僅是pH值在7.0培養(yǎng)過(guò)程的24%。對(duì)比不同條件下抗體融合蛋白的比生成速率，pH值7.2條件下抗體融合蛋白比生成速率與pH值7.0培養(yǎng)過(guò)程相比分別下降了63.1%、20.7%。

2.2.2 pH值對(duì)抗體融合蛋白唾液酸含量的影響 唾液酸廣泛存在于糖蛋白N-糖鏈或O-糖鏈的末端，研究表明，蛋白類(lèi)藥物中唾液酸含量對(duì)于藥物在體內(nèi)的半衰期有著重要的影響[13]。因此抗體融合蛋白的唾液酸化程度是衡量藥用蛋白質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。在不同pH值培養(yǎng)條件下抗體融合蛋

表2 pH值對(duì)抗體融合蛋白生成的影響

pH值 表達(dá)量

（g/L） 蛋白比生成速率

[pg（cell·d）]

6.8 0.90 17.8

6.9 1.28 17.2

7.0 1.35 17.9

7.2 0.32 14.2

白的唾液酸含量見(jiàn)圖3-A，可見(jiàn)隨著培養(yǎng)pH值的降低抗體融合蛋白的唾液酸含量呈明顯下降趨勢(shì)，在pH值6.8條件下的唾液酸含量?jī)H為pH值7.0條件下的73.5%。研究結(jié)果表明，降低培養(yǎng)過(guò)程中的pH值能夠顯著抑制抗體融合蛋白的唾液酸修飾。Gawlitzek等在研究氨對(duì)TNFR-Fc影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，提高培養(yǎng)基中氨的濃度（15 mmol/L）能顯著降低蛋白的唾液酸含量[14]。研究還表明，降低培養(yǎng)pH值能使氨的比生成速率顯著提高，這可能是在pH值6.8條件下唾液酸含量下降的主要原因。

抗體融合蛋白的生物學(xué)活性是評(píng)價(jià)產(chǎn)品生物學(xué)性質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。隨著培養(yǎng)過(guò)程中pH值的提高，抗體融合蛋白的生物學(xué)活性呈明顯下降趨勢(shì)。在pH值7.2的條件下，抗體融合蛋白的生物學(xué)活性?xún)H為pH值7.0條件下的45.1%（圖3-B）。可能是由于培養(yǎng)pH值改變引起了胞內(nèi)pH值的改變，影響了抗體融合蛋白的加工和修飾過(guò)程中酶活性的變化，從而影響了蛋白的翻譯后修飾。

2.2.3 pH值對(duì)抗體融合蛋白多聚體含量的影響 重組蛋白的聚合是影響重組蛋白質(zhì)量、安全的主要因素之一，不僅影響其生物學(xué)功能，而且有可能在體內(nèi)引起免疫反應(yīng)[15]。不同pH值條件下培養(yǎng)液中抗體融合蛋白單體和多聚體的含量見(jiàn)表3。結(jié)果表明，pH值為6.9的培養(yǎng)過(guò)程抗體融合蛋白多聚體含量最低，僅為5.87%，升高或降低pH值水平多聚體含量略有增加。考慮到多聚體的含量仍處于較高水平，可以進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)工藝或者通過(guò)下游純化的方法來(lái)進(jìn)一步降低多聚

表3 不同pH值條件下抗體融合蛋白多聚體含量

pH值

融合蛋白（%）

多聚體 單體

6.8 7.51 92.49

6.9 5.87 94.13

7.0 6.59 93.41

7.2 7.89 92.11

體的含量。

2.3 流加培養(yǎng)工藝的優(yōu)化及放大

通過(guò)研究，明確了過(guò)程控制參數(shù)pH值與產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量控制參數(shù)唾液酸、多聚體含量、產(chǎn)物生物學(xué)活性間的聯(lián)系，建立了產(chǎn)物質(zhì)量屬性和過(guò)程操作屬性間的關(guān)系，確認(rèn)pH值為抗體融合蛋白生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵控制參數(shù)。研究結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)pH值的提高，抗體融合蛋白的生物學(xué)活性呈一定程度的下降趨勢(shì)，但是抗體融合蛋白的唾液酸含量卻呈明顯的上升趨勢(shì)。在pH值6.9和pH值7.0的條件下，培養(yǎng)過(guò)程中的最大細(xì)胞密度、活力以及蛋白表達(dá)量均優(yōu)于其他條件。綜合考慮抗體融合蛋白的各個(gè)質(zhì)量指標(biāo)、細(xì)胞的生長(zhǎng)和表達(dá)情況以及反應(yīng)器控制時(shí)pH值的波動(dòng)問(wèn)題，在培養(yǎng)過(guò)程中pH值應(yīng)該控制在6.95±0.05。超過(guò)此范圍特別是pH值水平偏高達(dá)7.2時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制且維持不利，乳酸大量生成，關(guān)鍵質(zhì)量控制參數(shù)唾液酸和產(chǎn)物活性均有不同程度的降低。

通過(guò)培養(yǎng)pH值的優(yōu)化，并將流加培養(yǎng)工藝放大到30 L和200 L規(guī)模的反應(yīng)器，表現(xiàn)結(jié)果與2 L反應(yīng)器下的結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

在前期流加培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)考察流加培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝與產(chǎn)物合成以及產(chǎn)物各質(zhì)量參數(shù)的影響，結(jié)果表明：（1） 在pH值6.9和pH值7.0的條件下，最大細(xì)胞密度和細(xì)胞活力以及抗體融合蛋白的表達(dá)量均高于其他培養(yǎng)條件;（2） 培養(yǎng)過(guò)程中的pH值對(duì)細(xì)胞的乳酸或氨代謝有較顯著的影響;（3） 提高培養(yǎng)過(guò)程中的pH值，抗體融合蛋白的生物學(xué)活性呈顯著下降趨勢(shì)，而抗體融合蛋白的唾液酸含量卻呈上升趨勢(shì)。

將細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、表達(dá)以及抗體融合蛋白的各質(zhì)量參數(shù)綜合比對(duì)分析，確定6.95±0.05為過(guò)程的控制pH值，并成功放大到30 L和200 L反應(yīng)器規(guī)模。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)抗體融合蛋白的多聚體含量仍處于較高的水平，可以進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基、改變培養(yǎng)參數(shù)或者下游分離純化等方法降低抗體融合蛋白的多聚體含量。

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