酵母細胞表面上無機殼層的制備

姚成立+金濤+田寧寧

摘要：分別介紹了在酵母細胞的有氧呼吸過程中制備碳酸鈣外殼以及通過LBL自組裝方式結合維生素C的還原作用制備銀質外殼。結果表明，上述2種方式能有效防止酵母被化學試劑毒害，為未來的功能細胞研究奠定基礎。

關鍵詞：酵母;細胞殼;自組裝;碳酸鈣;銀質外殼;制備

中圖分類號： Q813 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0044-03

收稿日期：2014-05-02

基金項目：國家級大學生創新創業訓練計劃（編號：201314098038）;合肥師范學院校級科研項目（編號：2014cxy25）。

作者簡介：姚成立（1975—），男，安徽樅陽人，碩士，高級實驗師，主要從事生物無機化學研究。Tel：（0551） 63674145;E-mail：yaochengli@hftc.edu.cn。

細胞殼具備“外衣”功能在自然界并不少見，禽蛋、蠶繭和硅藻等皆屬于有殼保護的細胞。蠶繭在蠶蛹的生長發育過程中抵御外界的機械壓力、毒性物質和天敵的攻擊，傳遞蠶蛹的生命周期信息。蛋殼為胚胎發育提供了機械支持，并且維持它的生物活性。在硅藻和放射目的生物中，細胞壁外面密集排列的囊泡陣列，連續的硅骨架就在囊泡泡沫周圍的膜邊界成核，在硅藻細胞進入休眠期時為其提供保護外界的環境侵擾。若能以有殼細胞為啟示，通過為活細胞人工制造殼結構來改進細胞固有的性質和功能，會是一個極大的挑戰。與單細胞生物不同，真核細胞往往是被復雜的細胞外基質包裹和支持著，缺乏外殼的保護。目前的研究結果表明，通過生物硅化法、水凝膠法、聚電解質法LBL技術、靜電匹配直接沉淀法給真核細胞做外衣技術也已經有了可能，而且這些外衣為細胞的儲存、抵御有毒有害抗紫外線的能力大大加強。聚電解質法和靜電匹配法在構建細胞外殼時，是基于金屬納米粒子或者金屬離子與細胞表面的官能團—COOH或—NH2相互作用，在經化學修飾后表面具備異種電荷的細胞表面產生吸附作用[1-2]。目前使用經聚合物分散穩定的磁性納米粒子，成功在酵母[3-6]、細菌、微藻類、霉菌[7]的外表面上包裹上均勻PAH-四氧化三鐵納米粒子單層，這些磁性納米粒子在蛋白質分離、細胞收集、藥物緩釋等方面具有廣泛的潛力[8]。在酵母等細胞上已經成功地裹上了碳酸鈣[9-11]，碳酸鈣微殼（球霰石）直接沉積到酵母表面發生在沉淀過程中的Ca2+和CO2-3相遇在水溶液中的幾分鐘之內，所得到的核-殼“無機物@細胞”結構在水溶液中是穩定的，并且可以被存儲為幾個月，同時保留了細胞的生存能力。非常有趣的是，隨著酵母細胞的不斷分裂，體系中球霰石通過重結晶最終形成較大的方解石微粒。磷酸鈣殼通過LbL方式在酵母細胞的表面形成聚電解質殼，隨后在對細胞的鈣與磷酸鹽原位礦化。這種方式是通過聚電解質殼靜電吸引Ca2+，接著形成無定形磷酸鈣結構層，即相對厚約1 mm的礦物層[12]。此外，SiO2[13]、聚多巴胺[14]、TiO2[15]、氧化石墨烯[16]等細胞外殼液相繼制備，上述殼化細胞在細胞儲存、細胞保護、細胞輸送以及細胞治療等方面具有廣闊的應用前景，細胞殼化為調控和功能化細胞提供了一條行之有效的思路和策略。但上述合成方法都比較繁瑣，過多采用化學試劑不可避免會對酵母細胞產生毒害，從而降低試驗的成功概率。本研究介紹了通過酵母細胞的有氧呼吸產生CO2為碳源制備碳酸鈣外殼，以及在維生素C的還原作用下制備銀質細胞外殼。試驗結果表明，通過酵母自身的呼吸來提供碳源以及維生素C的還原作用降低了外在的化學毒素對細胞毒害的可能，為未來大量制備無機殼化的細胞提供了可能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母（Yeast，湖北安琪酵母有限公司）;氯化鈣（分析純）、氯化鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）、濃氨水（分析純）、維生素C（分析純）、硝酸銀（分析純）、磷鎢酸鈉（PTA，分析純）、聚二烯基丙二甲基氯化銨 （PDADMAC，分析純）、葡萄糖（生化試劑）、蛋白胨（生化試劑），均購自國藥集團上?；瘜W試劑有限公司，試驗用水全部為無菌水。紅外光譜用Nicolet870傅立葉紅外光譜儀測試，KBr壓片（掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描32次，分辨率4 cm-1），微觀粒子形貌在日本日立S-4800或1510掃描電子顯微鏡上完成，離心工作在低速臺式離心機（TDL-50C）上完成。

1.2 酵母細胞的培育

從市場購買的干酵母粉用無菌水溶解，在合適的溫度和營養下激活細胞，具體操作如下：在恒溫30 ℃、轉速為 220 r/min 的搖床中培養，培養液為YPD培養基（2%蛋白胨、1%酵母粉懸浮液、2%葡萄糖）。經過12 h的指數生長期之后，酵母細胞被離心收集（1 500 g）并用0.15 mol/L氯化鈉溶液清洗。

1.3 酵母細胞誘導碳酸鈣的制備

取2 mL酵母懸浮液和葡萄糖于250 mL經無菌處理過三角燒瓶中，快速倒入50 mL 0.05 mol/L CaCl2溶液中，同時加入一定量的氨水，調節pH值至微堿性，攪拌30 min，通入一定量的O2后用保鮮膜將三角瓶瓶口扎緊，置于恒溫30 ℃、轉速220 r/min的搖床上，經48 h呼吸作用后離心，收集三角瓶中的沉淀物，分別用去離子水和無水乙醇各洗滌3次，真空干燥6 h，再將固樣放在馬弗爐中400 ℃下焚燒，收集白色粉末，待測。

1.4 酵母細胞銀質殼的制備

取1 mL酵母懸浮液并分散在1 mg/mL PDADMAC溶液中，置于恒溫30 ℃、轉速220 r/min的搖床上搖晃15 min，然后在2 000 r/min下離心2 min，收集沉淀，棄除多余的PDADMAC，接著用無菌水洗滌沉淀細胞2次;再將洗滌后的酵母細胞分散于1 mg/mL磷鎢酸溶液中，接下來的操作過程如前所述，共循環3次，形成Yeast/PDADMAC/PTA自組裝包裹結構;再將上述包裹結構分散于0.05 mol/L AgNO3溶液中，在搖床上搖晃15 min，添加0.05 mol/L 維生素C溶液，繼續搖晃15～30 min，在轉速2 000 r/min下離心2 min，收集沉淀待測。