Cry9Aa3蛋白對小菜蛾和亞洲玉米螟的最小活性區研究

方龍發， 王小奇， 束長龍， 宋福平， 黃 勃， 張 杰＊

（1.安徽省微生物防治省重點實驗室，安徽農業大學，合肥 230036；2.中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

自從1981年第一個Bt cry類基因被克隆［1]，目前已克隆出771個Bt cry類基因（http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk／home／Neil－Crickmore／Bt／）。由于其具有對非靶標害蟲無毒，對環境安全等特點［1－2]，而廣泛用于轉基因作物［3]。隨著轉cry1A 類基因作物的大面積種植［4－5]，害蟲對Cry1A類蛋白產生了抗性［6－7]，而Cry9類蛋白與Cry1A類蛋白無交互抗性［8]，因此cry9類基因具有廣闊的應用前景。

目前，已發現36個cry9類基因（http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk／home／Neil－Crickmore／Bt／）。在第三等級上分為13類：cry9Aa、cry9Ba、cry9Bb、cry9Ca、cry9Da、cry9Db、cry9Ea、cry9Eb、cry9Ec、cry9Ed、cry9Ee、cry9Fa、cry9Ga，其中Cry9Bb蛋白對煙草天蛾（Manduca sexta）、大豆黧豆毛蟲（Velvetbean caterpillar）［9]等有活性；Cry9Ca蛋白對云杉卷葉蛾（Choristoneura fumiferana）［10]、夜小卷蛾（Epinotia aporema）［11]、煙草天蛾（Manduca sexta）［12]、歐洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）［13]等有殺蟲活性，Cry9Eb、Cry9Ee和 Cry9Ec蛋白對小菜蛾［14－15]有活性，而 Cry9Aa蛋白對亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）［8]、小 菜 蛾［16]、大 蠟 螟 （Galleria mellonella）、歐洲松帶蛾（Thaumetopoea pityocampa）［17]、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）［18]等多種鱗翅目害蟲具有殺蟲活性，應用價值較高。cry9Aa3是本實驗室從Bt菌株SC5D2中分離而來，對小菜蛾和亞洲玉米螟有較高活性，且與Cry1Ac蛋白無交互抗性［8]，是抗蟲轉基因作物理想的候選基因。

研究表明，在轉Bt基因的過程中，全長的cry類基因表達水平較低，截短的片段表達水平較高［19－20]。因此，當Bt基因用于轉化植物之前，確定其最小活性區是十分必要的。國內外對Cry蛋白最小活性區的研究報道已經很多，主要包括兩種方法：1）通過截短的方法確定最小活性區，如Cry1Ah蛋白（最小活性區位于50I與639E之間）［21]、Cry1Ba3蛋白（最小活性區位于22M～655L之間［22]、Cry1Ie1最小活性區位于活性區位于45M～648E之間［23]；2）蛋白經胰蛋白酶消化，純化后再進行N端測序，如Cry2Aa經酶解后形成50kDa片段［24]；Cry1Ac的最小活性區位于28R與623K之間［25－26]。

本文研究了Cry9Aa3蛋白12種不同長度的片段對小菜蛾和亞洲玉米螟的最小活性區域，為Cry9Aa殺蟲機理研究以及cry9Aa的商業化應用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株

Rosetta（DE3）（Stratagene）、SC5D2菌株（含有cry9Aa3的重組菌株）、pEB載體（氨芐抗性T7啟動子）。

1.2 序列分析和引物設計

根據cry9Aa3序列（GenBank登錄號：GQ249293），用DNAMAN分析工具獲得翻譯蛋白序列，提交于二級預測 網 站 （http：∥www.biogem.org／tool／choufasman／）預測二級結構，并用SWISS－MODEL在線建模工具模擬Cry9Aa3蛋白的三級結構，綜合考慮二級結構和三級結構預測結果，設計如下幾對引物（表1）。在線（http：∥web.expasy.org／compute＿pi／）分析各截短片段的PI值和分子量，并用Harrison兩個參數的統計學模型預測重組蛋白表達的可溶性［27]。

表1 引物序列及酶切位點Table 1 DNA sequences of primers and restriction enzyme sites on the primers

1.3 基因的擴增、克隆及序列的測定

以菌株SC5D2質粒DNA為模板，利用Primerstar高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，反應程序為：94℃預變性10min，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環。將回收純化的PCR產物克隆到pEB載體［28]，篩選出正確的陽性轉化子并測序（北京華大基因有限公司）。

1.4 Cry9Aa截短蛋白的表達和SDS－PAGE分析

將鑒定正確的重組質粒轉入表達菌株Rosetta（DE3）在菌體 A600nm為0.5 時，加入終濃度為1.0mmol／L IPTG，16 ℃、150r／min誘導12h進行表達。在4℃、12 000g離心收集菌體，用20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）緩沖液懸浮細胞并進行超聲波破碎（美國SonicsVCX500），超聲條件：功率70%，超聲10min（處理5s停5s）。然后分別將可溶組分和不可溶組分進行SDS－PAGE分離。蛋白電泳樣品制備與SDS－PAGE電泳檢測參見Sambrook等的方法［29]。

1.5 生物活性的分析

供試昆蟲：小菜蛾（Plutella xylostella）由本實驗室提供；亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）由綻諾思特公司提供。

對于有活性的截短蛋白，選取蛋白終濃度為0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9μg／g 作 為 生 測濃度，對于喪失活性的截短蛋白，選取200μg／g作為生測濃度，并以只有pEB載體Rosetta菌株作為陰性對照。亞洲玉米螟生測［30]使用人工飼料，小菜蛾［28]生測使用甘藍菜葉。生測數據采用SPSS 13.0軟件計算LC［31]。

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2 結果與分析

2.1 信息學結果

2.1.1 序列特征

Cry9Aa3蛋白存在3個保守結構域，即Domain I由N端第60～290位共231個氨基酸組成；Domain II由第295～508位共214個氨基酸組成；DomainⅢ由第513～655位共143個氨基酸組成。因此，其最小活性區可能位于60V～655V。

2.1.2 預測的二級結構

預測該蛋白的N端二級構型應該是α－螺旋，α′－2螺旋與三級結構所預測的α－1螺旋存在疊合區域（圖1）。據此，推測α′－2螺旋可能會影響該蛋白的活性，而45位氨基酸是α′－2螺旋的起始氨基酸（圖1），它可能對維持蛋白活性有重要作用，它的缺失可能會引起蛋白活性的喪失。β′－1折疊與預測的三級結構的β－23折疊基本重合，只在C端有一個氨基酸的差異（655位）。

圖1 Cry9Aa3蛋白二級結構預測Fig.1 The predicted secondary structure of Cry9Aa3toxin

2.1.3 預測的三級結構

根據 SWISS－MODEL 預 測 的 三 級 結 構，Cry9Aa3蛋白3個結構域位于54D與655V之間（圖2）。最終，根據以上預測結果，確定了44、45、46、54、60、70、652、653、654、655、700共11個截短位點。

圖2 Cry9Aa3三級預測結構（SWISS－MODEL）Fig.2 The predicted 3Dstructure of Cry9Aa3 toxin（SWISS－MODEL）

2.2 不同截短片段的克隆與檢測

按表2中的引物對，進行PCR擴增，得到不同長度的cry9Aa3的基因片段（圖略）。將PCR產物酶切消化后分別與pEB載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，篩選出正確的陽性克隆，并提取質粒。

2.3 表達的片段及其性質分析

不同長度的cry9 Aa3基因在Rosetta菌株中都有表達（圖3、4），根據不同蛋白的分子量（表2），可知Cry9Aa3－1～700蛋白比Cry9Aa3－1～1151截短蛋白小，而比其他的截短片段大，而其他的截短片段之間分子量差異很小，這與圖2中蛋白大小趨勢符合。此外，所有截短蛋白分子量都比經胰蛋白酶消化后所形成的片段大（圖4）。根據表2中CV－CV′值，所有截短蛋白的CV－CV′＞0，這時，P 表示不可溶性概率，P值越大表示該蛋白在過表達時，不可溶的可能性越大，而表2中截短蛋白相對全長蛋白P值小，說明截短蛋白的可溶性優于全長蛋白。據此，可能會得到上清表達量較高的截短蛋白，而圖4中的Cry9Aa3－1～654、Cry9Aa3－1～655蛋白上清表達量明顯高于全長蛋白，符合預測的結果。

表2 不同截短蛋白的特性分析1）Table 2 Characterization of different truncated fragments of Cry9Aa3protein

圖3 SDS－PAGE分析Cry9Aa3各截短蛋白在大腸桿菌中的表達（沉淀）Fig.3 SDS－PAGE analysis of the truncated Cry9Aa3polypeptides expressed in E.coli

2.4 不同截短蛋白的生物活性

不同長度Cry9Aa3截短蛋白對小菜蛾和亞洲玉米螟的生物活性見表3。

表3 不同長度Cry9Aa3截短蛋白對小菜蛾和亞洲玉米螟的生物活性測定結果Table 3 Bioassay results of different expression products against the larvae of P.xylostellaand O.furnacalis

表3中陽性對照Cry9Aa3－1～1151對小菜蛾（LC502.63μg／g）和亞洲玉米螟（LC505.34μg／g）的毒力都較高，且截短蛋白Cry9Aa3－1～700、Cry9Aa3－1～654、Cry9Aa3－1～655、Cry9Aa3－44～700、Cry9Aa3－45～700對小菜蛾和亞洲玉米螟的毒力與陽性對照差異不顯著（P＞0.05），而截短蛋白Cry9Aa3－1～653、Cry9Aa3－1～652、Cry9Aa3－46～700、Cry9Aa3－54～700、Cry9Aa3－60～700、Cry9Aa3－70～700對小菜蛾和亞洲玉米螟幾乎喪失活性。因此，可以確定，Cry9Aa3蛋白對小菜蛾和亞洲玉米螟的最小活性區位于45I～654P之間。

3 討論

1991年，第一個cry9Aa基因就被克隆［32]，但至今關于Cry9Aa蛋白機理研究的文章難覓，主要原因可能是Cry9Aa蛋白的表達存在問題。Cry9Aa蛋白在Bt無晶體突變體中不表達，在大腸桿菌中主要是以包涵體的形式存在，在上清中表達量極低（未發表資料），無法純化和用于殺蟲機理研究。本研究通過可溶性預測模型［27]對各截短片段的可溶性進行預測，發現截短蛋白相對于全長蛋白，其可溶性的概率提高，說明其上清表達量比全長蛋白高。所有Cry9Aa3截短蛋白上清表達量都高于Cry9Aa3全長蛋白表達量（圖4），其中Cry9Aa3－1～654、Cry9Aa3－1～655蛋白相對其他截短蛋白可溶性比例提高最為顯著，與預測結果相符，這為推進Cry9Aa蛋白的機理研究奠定了基礎。本研究還發現截短的Cry9Aa3蛋白的pI值為8.1左右，而Cry2Ab4蛋白的預測pI值為8.73（http：∥web.expasy.org／compute＿pi／），這兩者同屬于弱堿性蛋白，它們是否存在相似的殺蟲機制，以及Cry2Ab的晶體輔助蛋白是否能輔助Cry9Aa3截短蛋白在HD73無晶體突變株表達，這些都值得進一步探索。

目前，已有9種Cry／Cyt蛋白的晶體結構被解析，如CrylAa、Cry2Aa、Cry3Aa、Cry4Aa等［33－36]。由于Cry9Aa蛋白與現在已解析三維空間結構的Cry蛋白的氨基酸序列相似性低（30%左右），在同源建模的過程中無合適的模板，故所建模型準確度較低（ERRAT http：∥services.mbi.ucla.edu／SAVES／，得分為44.874）。因此，本研究綜合考慮三級結構和二級結構預測結果，設計700、655、654、653、652、54、60、70、46、45、44十一個截短位點，在C端截至654位氨基酸時有活性，而截至653位時喪失活性，結合圖2，655位氨基酸的缺失并不影響DomainⅢ的β－23結構的完整性；而654位氨基酸的缺失會影響DomainⅢ的β－23結構的完整性［37]，這說明 DomainⅢ中的β－23折疊片，是保持DomainⅢ功能所不可缺少的部分，這與Cry1Ba截短試驗的結論一致［22]。而在N端截至45位時，該截短蛋白有活性，而截至46位時，其活性喪失，根據預測的二級結構的結果，46位氨基酸是α′－2螺旋的起始氨基酸，截去該氨基酸會影響此螺旋的完整性，再結合預測的三級結構結果，二級結構的α′－2螺旋應該是三級結構的α－1螺旋，說明α－1螺旋是維持蛋白殺蟲活性的重要結構。這與某些蛋白的結論相似，如Cry1AMod毒素，它缺失α－1螺旋，影響其對敏感昆蟲的殺蟲活性［38]；而與另一些蛋白的結論相矛盾，如Cry2Aa蛋白和Cry5Ba蛋白，它們都缺失α－4螺旋前的所有區域，仍然具有殺蟲活性［24，39]。綜上所述，α螺旋對蛋白活性的影響與蛋白的種類有關，今后需要更多的實驗證據來驗證。

本研究最小活性區的確定為高效多價工程菌和轉基因作物的研制創造了有利條件，具有重要的理論意義和應用價值。

［1]Schnepf H E，Whiteley H R.Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli［J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1981，78（5）：2893－2897.

［2]Chen M，Zhao J Z，Collins H L，et al.A critical assessment of the effects of Bt transgenic plants on parasitoids［J].PLoS ONE，2008，3（5）：e2284.

［3]James C.Global status of commercialized biotech／GM Crops：2013 ［J].ISAAA in Brief，2013，46：1－13.

［4]Wu K M，Lu Y H，Feng H Q，et al.Suppression of cotton bollworm in multiple crops in China in areas with Bt toxin－containing cotton［J].Science，2008，321（5896）：1676－1678.

［5]Bates S L，Zhao J Z，Roush R T，et al.Insect resistance management in GM crops：past，present and future［J].Nature Biotechnology，2005，23（1）：57－62.

［6]Storer N P，Babcock J M，Sclenz M，et al.Discovery and characterization of field resistance to Bt maize：Spodoptera frugiperda （Lepidoptera：Noctuidae）in Puerto Rico［J].Journal of Economic Entomology，2010，103（4）：1031－1038.

［7]Zhang H，Yin W，Zhao J，et al.Early warning of cotton bollworm resistance associated with intensive planting of Bt cotton in China［J].PLoS ONE，2011，6（8）：e22874.

［8]蘇慧琴，束長龍，何康來，等.蘇云金芽孢桿菌cry9Aa基因的克隆，表達及活性分析［J].植物保護學報，2010，37（6）：541－546.

［9]Silva－Werneck J O，Ellar D J.Characterization of a novel Cry9Bbδ－endotoxin fromBacillus thuringiensis［J].Journal of Invertebrate Pathology，2008，98（3）：320－328.

［10]Pang A S D，Gringorten J L，Frankenhuyzen K.Interaction between Cry9Ca and two Cry1A δ－endotoxins from Bacillus thuringiensis in larval toxicity and binding to brush border membrane vesicles of the spruce budworm，Choristoneur afumiferana Clemens［J].FEMS Microbiology Letters，2002，215（1）：109－114.

［11]Sauka D H，Sánchez J，Bravo A，et al.Toxicity of Bacillus thuringiensisδ－endotoxins against bean shoot borer （Epinotia aporema Wals.）larvae，a major soybean pest in Argentina［J].Journal of Invertebrate Pathology，2007，94（2）：125－129.

［12]Brunet J F，Vachon V，Juteau M，et al.Pore－forming properties of the Bacillus thuringiensis toxin Cry9Ca in Manduca sexta brush border membrane vesicles［J].Biochimica et Biophysica Acta－Biomembranes，2010，1798（6）：1111－1118.

［13]Hua G，Masson L，Jurat－Fuentes J L，et al.Binding analyses of Bacillus thuringiensis Cryδ－endotoxins using brush border membrane vesicles of Ostrinia nubilalis［J].Applied and Environmental Microbiology，2001，67（2）：872－879.

［14]Shu C，Su H，Zhang J，et al.Characterization of cry9 Da4，cry9Eb2，and cry9Ee1genes fromBacillus thuringiensis strain T03B001［J].Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（22）：9705－9713.

［15]Wasano N，Saitoh H，Maeda M，et al.Cloning and characterization of a novel gene cry9Ec1encoding lepidopteran－specific parasporal inclusion protein from a Bacillus thuringiensis serovar galleriae strain［J].Canadian Journal of Microbiology，2005，51（11）：988－995.

［16]Kuvshinov V，Koivu K，Kanerva A，et al.Transgenic crop plants expressing synthetic cry9Aa gene are protected against insect damage［J].Plant Science，2001，160（2）：341－353.

［17]Marchetti E，Alberghini S，Battisti A，et al.Effects of conventional and transgenic Bacillus thuringiensis galleriae toxin on Exorista larvarum （Diptera：Tachinidae），aparasitoid of forest defoliating Lepidoptera ［J].Biocontrol Science and Technology，2009，19（5）：463－473.

［18]Naimov S，Nedyalkova R，Staykov N，et al.A novel Cry9Aa with increased toxicity for Spodoptera exigua （Hübner）［J].Journal of Invertebrate Pathology，2014，115：99－101.

［19]Vaeck M，Reynaerts A，H?fte H，et al.Transgenic plants protected from insect attack［J].Nature，1987，328：33－37.

［20]Zaidi M A，Ye G，Yao H，et al.Transgenic rice plants expressing a modified cry1Ca1gene are resistant to Spodoptera litura and Chilo suppressalis［J].Molecular Biotechnology，2009，43（3）：232－242.

［21]Xue J，Zhou Z，Song F，et al.Identification of the minimal active fragment of the Cry1Ah toxin［J].Biotechnology Letters，2011，33（3）：531－537.

［22]王廣君，張杰，吳雋，等.蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白Cry1Ba3活性區的研究［J].中國農業科學，2005，38（8）：1585－1590.

［23]吳玉娥，張杰，曹景萍，等.蘇云金芽胞桿菌Cry1Ie1蛋白末端缺失的研究［J].植物保護，2003，29（5）：15－18.

［24]Ohsawa M，Tanaka M，Moriyama K，et al.A 50－kilodalton Cry2A peptide is lethal to Bombyx mori and Lymantria dispar ［J].Applied and Environmental Microbiology，2012，78（13）：4755－4757.

［25]Nagamatsu Y，Itai Y，Hatanaka C，et al.A toxic fragment from the entomocidal crystal protein of Bacillus thuringiensis［J].Agricultural and Biological Chemistry，1984，48（3）：611－619.

［26]Bietlot H P，Carey P R，Pozsgay M，et al.Isolation of carboxyl－terminal peptides from proteins by diagonal electrophoresis：Application to the entomocidal toxin fromBacillus thuringiensis［J].Analytical Biochemistry，1989，181（2）：212－215.

［27]張颋，王菊芳，馮延葉，等.可溶性預測模型在包涵體復性中的應用［J].南方醫科大學學報，2009，29（11）：2156－2160.

［28]張靜濤，束長龍，宋福平，等.蘇云金芽胞桿菌cry2Ad基因的克隆及其表達產物的活性分析［J].生物技術通報，2009（10）：146－150.

［29]Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning a laboratory manual［M].New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

［30]韓海亮，李光濤，王振營，等.Cry1Ac抗性亞洲玉米螟對四種Bt蛋白的交互抗性［J].植物保護學報，2009（4）：329－334.

［31]陳平雁.SPSS 13.0統計軟件應用教程［M].北京：人民衛生出版社，2005.

［32]Smulevitch S V，Osterman A L，Shevelev A B，et al.Nucleotide sequence of a novelδ－endotoxin gene cryIgof Bacillus thuringiensis ssp.galleriae［J].FEBS Letters，1991，293（1）：25－28.

［33]Grochulski P，Masson L，Borisova S，et al.Bacillus thuringiensis cryIA（a）insecticidal toxin：crystal structure and channel formation［J].Journal of Molecular Biology，1995，254：447－464.

［34]Morse R J，Yamamoto T，Stroud R M.Structure of Cry2Aa suggests an unexpected receptor binding epitope［J].Structure，2001，9（5）：409－417.

［35]Li J，Carroll J，Ellar D J.Crystal structure of insecticidalδ－endotoxin fromBacillus thuringiensis at 2.5－resolution［J].Nature，1991，353：815－821.

［36]Boonserm P，Mo M，Angsuthanasombat C，et al.Structure of the functional form of the mosquito larvicidal Cry4Aa toxin fromBacillus thuringiensis at a 2.8－angstrom resolution［J].Journal of Bacteriology，2006，188（9）：3391－3401.

［37]Fernández L E，Pérez C，Segovia L，et al.Cry11Aa toxin from Bacillus thuringiensis binds its receptor in Aedes aegypti mosquito larvae through loopα－8of domainⅡ ［J].FEBS Letters，2005，579（17）：3508－3514.

［38]Soberón M，Pardo－López L，López I，et al.Engineering modified Bt toxins to counter insect resistance［J].Science，2007，318（5856）：1640－1642.

［39]Griffitts J S，Huffman D L，Whitacre J L，et al.Resistance to a bacterial toxin is mediated by removal of a conserved glycosylation pathway required for toxin－host interactions［J].Journal of Biological Chemistry，2003，278（46）：45594－45602.