小水榕莖部內生菌的分離及鑒定

王繼華等

摘 要 采用稀釋涂板法，對小水榕莖部的內生菌進行分離、純化及16S rDNA鑒定，通過同源性比對構建系統發育樹。結果表明：分離到的24株內生菌分別屬于5個類群（Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Filimonas）的11個屬（Phenylobacterium、Rhizobium、Caulobacter、Sphingobium、Paenibacillus、Staphylococcus、Bacillus、Pseudomona、Chitinophaga sancti、Filimonas、Agrobacterium），其中Alphaproteobacteria、Firmicutes為優勢種群，占總數的45.8%；所有菌株與其同源菌株的相似性均在98% 以上。本研究有助于揭示小水榕莖部內生菌的多樣性，為發掘其應用潛力提供參考資料。

關鍵詞 植物內生菌 ；小水榕 ；16S rDNA

分類號 S567.3

Abstract A total of 24 isolates of Endophytic bacteria from the inside of the stem of Anubias barteri was isolated by spread-plate method. These isolates were aligned by using the sequences of 16S rDNA and then the phylogenetic tree was constructed. The result showed that 24 isolates belong to 11 genus（Phenylobacterium， Rhizobium， Caulobacter， Sphingobium， Paenibacillus， Staphylococcus， Bacillus， Pseudomona， Chitinophaga sancti， Filimonas， Agrobacterium） of 5 groups（Alphaproteobacteria， Gammaproteobacteria， Firmicutes， Bacteroidetes， Filimonas）. The identity of all isolates were more than 98% same as the sequence of bacteria's in NCBI and 45.8% of them were Firmicutes that were dominant species. The result was beneficial for further study of the diversity of endophytic bacteria in Anubias barteri's stem.

Keywords endophytic bacteria ； Anubias barteri ； 16S rDNA

植物內生菌是指一切生活在植物組織和器官內部但不引起外在癥狀的真菌、細菌和放線菌等，包括內共生微生物以及潛伏在宿主體內的病原菌和菌根菌[1]。現已證實，大部分植物（例如水稻、甘蔗、番茄、石斛、紅豆杉和桉樹等）均含有內生菌[2]。植物種類和生長環境等不同都會導致內生菌的種類和數量有所差異，同一種植物在不同的組織部位和生長階段，其內生菌的多樣性不同，表現出一定的宿主專化性和地域專化性[3-4]。目前發現的內生細菌已超過129種，分別屬于54個屬。這些內生細菌多為土壤微生物種類，其中假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬以及土壤桿菌屬為常見的屬[5]。內生真菌大多數屬于子囊菌類及其無性型， 包括核菌綱（Pyrenomyete）、盤菌綱（Discomyetes）和腔菌綱（Loculoascomyete）的許多種類；而內生放線菌主要是絲狀放線菌、鏈霉菌屬[6-7] 。大多數內生菌通過產生次生代謝物質，如植物生長素、赤霉素、吲哚乙酸等以及通過生物固氮均可促進植物生長[8-10]。內生菌可以通過產生抗生素、酶來直接抑制或降解病原菌，也可以通過誘導植物產生防御性物質（如酚類、醌類物質等），并在細胞間隙中積累該類物質來阻擋病原菌入侵[11-12]。內生菌所產生的一些包括生物堿在內的毒素可致使植食昆蟲拒食、體重減輕、生長發育受到抑制甚至死亡[13]。有些內生菌能合成醫用抗癌物質，如從多種紅豆杉屬植物中可分離到能夠合成紫杉醇類化合物的內生菌[14]。內生菌有可能成為農業上防治作物病蟲害的綠色有效資源和醫用抗生素和抗癌藥物的新來源。因此，研究植物內生菌的多樣性和開發其生物學功能具有十分重要的意義[15]。

小水榕（Anubias barteri）原產于非洲西部，主要分布在以喀麥隆為中心的西非地區，屬于天南星科榕葉屬水草類沉水植物。葉形與榕樹的葉子相似，呈倒卵形，肉穗花序為黃色，葉形佛焰苞，也能在水中開花。生長極為緩慢，葉色常綠，是一種極具觀賞價值的優良水草， 作為中前景草在水族箱中應用廣泛，市場銷售量大，目前已作為一種經濟植物在中國華南地區被大量種植[16]。由于長期在水中生長，小水榕的內生菌非常豐富，這也給通過組織培養獲得無菌外植體帶來困難[17]。關于小水榕的研究相對落后，在內生菌方面的研究還未見報道。本研究通過對小水榕莖部內生細菌的分離以及16S rDNA分子鑒定，探討小水榕莖部內生細菌的多樣性，為分析影響小水榕組織培養的因素和了解其在生長過程中與寄主間的互作關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以小水榕（Anubias barteri）為試驗材料，種植于廣東省廣州市芳芳水榕培育場。于2014年12月選取生長正常、無病蟲害的小水榕莖部進行內生菌的分離。

1.2 方法

1.2.1 內生菌的分離及培養

（1）切取近根部1～2 cm的小水榕莖段，剪去葉片和葉柄，先用自來水沖洗30 min，將莖表面沖洗干凈；（2）用無菌濾紙吸干莖表面的水滴，再分別用75%酒精浸泡1 min和0.1%升汞浸泡3 min進行消毒，之后用滅菌水沖洗4～5次，每次3 min，用滅菌濾紙吸干；（3）取100 μL最后一次沖洗過的無菌水直接接種在NA培養基上，將其作為對照檢驗莖段表面消毒的效果；（4）將滅菌后的莖段放進盛有50 μL無菌水的研缽，用研棒擠壓小水榕莖段汁液，并用移液器將其收集至1.5 mL離心管中；（5）用無菌的0.01 mol/L磷酸緩沖液（PBS）將莖段汁進行梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍）后，各取100 μL涂布于NA培養基上， 于28℃培養3 d后進一步挑取單菌落劃線純化，共分離純化2～3次；（6）用25%的甘油將其保存于-80℃冰箱備用[18]。

1.2.2 內生菌16S rDNA擴增及測序

采用水煮法提取細菌DNA。挑取純化后的單菌落于1.5 mL離心管中，加入20 μL無菌水，加熱煮沸10 min，離心后的上清液即為DNA溶液，再取1～2 μL作為PCR 模板進行16S rDNA片段擴增，擴增引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和1492R （5′-GGCTACCTTGTTACGACT T-3′）。擴增條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 100 s，共35個循環；72 ℃ 5 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對特異的PCR產物進行測序，采用引物27F和1492R雙向測序，之后進行拼接，最后得到16S rDNA序列。

1.2.3 內生菌16S rDNA 序列測定及同源性比對

（1）獲得各菌株16S rDNA序列后，分別與GenBank 數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的已知序列進行BLAST比對分析，尋找具有較高同源性的16S rDNA序列，確定其種類。（2）用Clustal X 對內生菌的序列進行比對，再用Mega 6進行系統發育分析[19]。

2 結果與分析

2.1 小水榕莖部內生菌的分離純化

于28℃培養2～3 d后，對照培養基上無明顯菌落長出，表明試驗材料表面已被消毒徹底。而在涂布莖段汁的培養基上出現明顯的形態各異的菌落，表明小水榕莖部存在著種類豐富的大量內生菌。經過2～3次的進一步分離純化，按照菌落形態特征進行篩選，最終共獲得24株不同的內生菌（表1），部分內生菌菌落形態見圖1。

2.2 16S rDNA序列擴增鑒定及系統發育分析

對所獲得的內生菌16S rDNA序列進行擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小為1.5 kb左右的特異條帶，與預期大小相符（圖2）。將PCR產物回收、測序，去掉低質量堿基后，rDNA長度在1.3～1.5 kb。

將所獲得的內生菌16S rDNA片段序列與NCBI中的已知序列進行BLAST比對，結果顯示大部分菌株16S rDNA序列與已知序列的同源性達到98%以上（表2）。24株內生菌共分為5個類群，分別為阿爾法變形菌（Alphaproteobacteria）、伽瑪變形菌（Gammaproteobacteria）、厚壁菌（Firmicutes）、擬桿菌（Bacteroidetes）、腐漿細菌（Filimonas sp.），共計11個屬。其中，阿爾法變形菌類和厚壁菌類為優勢種群，占總數的45.8%（圖3）。分離得到的8個菌株（SR-3、SR-5、SR-6、 SR-8、SR-12、SR-15、SR-27、SR-29）分別屬于阿爾法變形菌類的5個屬（Phenylobacterium、Rhizobium、Caulobacter、Sphingobium、Agrobacterium）；11個菌株（SR-1、SR-2、SR-7、SR-10、SR-16、SR-17、SR-19、SR-20、SR-25、SR-26、SR-28）分別屬于厚壁菌類的3個屬（Paenibacillus、Staphylococcus、Bacillus）；關于伽瑪變形菌類分離到一個屬（Pseudomonas）的3個菌株（SR-4、SR-14、SR-23）；關于擬桿菌類分離到一個屬（Chitinophaga sancti）的一個菌株（SR-21）；腐漿細菌（Filimonas）未有明確的生物學分類。系統發育分析結果見圖4。

3 討論與結論

植物內生菌在促進植物生長、開發綠色環保的抗病蟲劑和抗癌物質等方面有著巨大的應用潛力和研究價值[20-21]。同時，內生菌與植物的互利共生關系、內生菌群體之間及內生菌與植物之間的動態平衡也是研究的熱點[22-24]。小水榕是一種水生植物，研究結果表明，其莖部內生菌類型豐富。分離得到的24株內生菌分別屬于5個類群的11個屬，其中阿爾法變形菌（Alphaproteobacteria）和厚壁菌（Firmicutes）為優勢種群。在生產上為滿足市場對種苗的需求，小水榕的快速繁殖主要依靠植物組織培養技術，但其內生菌帶來的污染十分嚴重，導致組培苗成活率較低。小水榕的快繁多以莖段側芽為外植體，而內生菌的存在是影響組織培養的一個重要因素，導致組培苗生產中污染率高、成苗困難、生產成本增加。在種植中也發現脫毒的小水榕組培苗生長速率明顯快于多年生長的老苗，這可能是因為老苗長期生長在一個相對穩定的環境中，溫度、水分、光照等對其影響較小，也可能是因為小水榕莖部中的內生菌種類相對較多[25]。因此，有必要進一步了解小水榕內生菌的種類、功能及其與宿主的關系，以便進行更深入的研究。

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