橙皮苷對大鼠心肌缺血/再灌注損傷誘導自噬的影響機制研究

李雪飛，江洪，胡笑容，馬瑞松

論著·基礎

橙皮苷對大鼠心肌缺血/再灌注損傷誘導自噬的影響機制研究

李雪飛，江洪，胡笑容，馬瑞松

目的 探討橙皮苷對大鼠心肌缺血/再灌注損傷誘導的心肌細胞自噬的影響及其可能機制。方法 24只雄性SD大鼠隨機均分為假手術組、缺血/再灌注(I/R)組及橙皮苷組，每組8只。假手術組予0.5%羧基纖維素鈉灌胃3 d后，開胸暴露冠狀動脈左前降支(LAD)，并不結扎，I/R組及橙皮苷組予以阻斷LAD血流30 min后再灌注4 h，建立大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型。術后，檢測大鼠血清中肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)，心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及自噬蛋白微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ(LC3Ⅱ)和Beclin1的水平。結果 與假手術組相比，I/R組大鼠血清中CK及LDH水平均顯著升高，心肌組織SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P均<0.05)；與I/R組比較，橙皮苷組大鼠血清中CK及LDH水平明顯降低，心肌組織SOD活性顯著升高，MDA含量明顯降低(P均<0.05)。與假手術組比較，I/R組大鼠心肌組織LC3Ⅱ及Beclin1表達水平顯著增高，與I/R組比較，橙皮苷組上述2項指標表達水平明顯降低(P<0.05)。結論 橙皮苷可抑制心肌缺血/再灌注損傷誘導的心肌細胞自噬，其機制與橙皮苷減輕氧化應激相關。

橙皮苷；心肌缺血再灌注損傷；自噬；氧化應激；大鼠

對于急性心肌梗死患者，再灌注治療是拯救缺血心肌及改善臨床預后的最佳手段。而再灌注本身可使尚存活的心肌細胞死亡，進而加重心肌損傷[1]。自噬作為維持細胞穩態的一種自我保護機制，在生理情況下可降解及再利用老化的長壽蛋白質及膜包被的細胞器[2]。然而過度的自噬可溶解正常的蛋白質及細胞器，導致細胞死亡[3]。研究表明，自噬在心肌缺血/再灌注損傷中有著重要的作用[4]。在心肌缺血期間，自噬可降解無重要功能的蛋白質為細胞的生命活動提供能量，起到保護心肌的作用；而在再灌注期間，自噬可被過度激活從而導致細胞損傷及死亡，進而加重心肌缺血/再灌注損傷[5]。

橙皮苷屬于黃烷酮類化合物，在橘柑類的水果中含量豐富，具有抗氧化、抗炎、抗電離輻射等多重生物活性[6～8]。有研究報道，橙皮苷可減輕心肌缺血/再灌注損傷，表現為抑制心肌細胞凋亡及減輕氧化應激，但其對自噬的影響目前尚未見報道[9，10]。故本實驗旨在探討橙皮苷在心肌缺血/再灌注期間對自噬的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：SPF級雄性SD大鼠24只，體質量200～250 g，購于武漢大學動物實驗中心，飼養環境維持25℃、黑暗與照明各交替12 h。術前12 h禁食、不禁飲。(2)主要試劑：橙皮苷(HPLC>90.0 %)及羧基纖維素鈉(購于國藥集團化學試劑有限公司)，戊巴比妥鈉(購于美國Sigma公司)。主要儀器：Biopac多導生理記錄儀、計算機圖像分析系統(Image-Pro Plus3.0，Media Cyerneties公司)，熒光顯微鏡(BX53，中國奧林巴斯有限公司)。

1.2 動物模型建立及分組 (1)建立模型： 0.5%羧基纖維素鈉或橙皮苷混懸液灌胃3 d后，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將其固定于解剖臺，氣管插管，連接動物呼吸機通氣(70次/min)，連續監測肢體II導聯的心電圖。左胸廓切開術暴露心臟，剪開心包膜，在肺動脈圓錐與左心耳下緣之間找到左前降支(LAD)，將5-0絲線用手術彎針穿至LAD下，結扎處放置微小塑料管。阻斷LAD 30 min后，剪斷結扎線，取出塑料管，再灌注4 h。造模成功標準：缺血時肢體II導聯ST段抬高及心臟表面變蒼白或紫紺，再灌注后ST段回落1/2以上，心臟表面蒼白或紫紺區變紅。(2)實驗分組：24只大鼠隨機均分為假手術組、缺血/再灌注(I/R)組及橙皮苷組，每組8只。假手術組：0.5%羧基纖維素鈉灌胃3 d后，只穿線，不結扎[11]；I/R組：0.5%羧基纖維素鈉灌胃3 d后，阻斷LDA 30 min，再灌注4 h；橙皮苷組：0.5%羧基纖維素鈉與橙皮苷(200 mg/kg)混懸液灌胃3 d后，阻斷LAD 30 min，再灌注4 h[12]。

1.3 觀測指標 術后大鼠均取頸靜脈血離心，取上清液備用；取出心臟，剪取左心室缺血區心肌組織存于-80℃冰箱備用。

1.3.1 血清心肌酶的測定： 大鼠再灌注后，經頸靜脈采血2 ml，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用全自動生化分析儀測定血清中肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)含量(試劑盒購于南京建成生物工程研究所)。

1.3.2 心肌組織氧化應激指標的測定: 冰凍缺血區心肌組織勻漿，4 000 r/min離心，取上清液。根據試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書步驟檢測超氧化物歧化酶(SOD)的活力及丙二醛(MDA)的含量。

1.3.3 心肌組織自噬蛋白檢測: 冰凍缺血區心肌組織勻漿，取適量組織裂解液提取心肌組織總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度。取50 μg總蛋白上樣，經10% SDS-PAGE分離，4℃下恒壓轉膜，室溫下用含5%脫脂奶粉TBST封膜2 h，加入抗微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)抗體(稀釋1∶1 000)或抗Beclin1(稀釋1∶1 000)(皆購于美國Cell Signaling Technology 公司)，4℃孵育過夜；TBST充分洗膜，加入辣根過氧化酶標記二抗，室溫孵育2 h；漂洗后滴加適量化學發光(ECL)底物液，孵育數分鐘后常規顯影。使用計算機圖像分析系統分析條帶灰度值，磷酸甘油醛胱氫酶(GAPDH)標準化待測蛋白的表達。

1.3.4 免疫熒光法觀察心肌組織LC3 II表達: 10%甲醛固定心肌，石蠟包埋后切片。石蠟切片經脫蠟、抗原修復、血清封閉后，滴加鼠抗兔抗LC3 II抗體(稀釋1∶100)(購自美國Cell Signaling Technology 公司)，4℃孵育過夜；PBS沖洗玻片后，滴加熒光標記的羊抗兔IgG(購自武漢博士德生物工程有限公司)，濕盒中37℃孵育1 h。在暗室中滴加細胞核染色劑4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，購自中國碧云天生物公司)孵育5 min，PBS沖洗后擦干封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。其中細胞核呈藍色，LC3 II呈綠色。

2 結 果

2.1 血清心肌酶水平 與假手術組相比，I/R組大鼠血清中CK及LDH水平均顯著升高(t=-4.273、-7.894，P均<0.05)，提示再灌注后心肌損傷加重；而橙皮苷組大鼠血清中CK及LDH的水平明顯低于I/R組(t=4.179、6.430，P均<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清心肌酶CK及LDH的變化

注：與假手術組比較，aP<0.05；與I/R 組比較，bP<0.05

2.2 心肌組織SOD及MDA水平 與假手術組相比，I/R組大鼠心肌組織SOD的活性顯著降低,而MDA含量顯著升高(t=10.097、-6.863,P均<0.05)，表明心肌缺血/再灌注后心肌組織氧化應激反應增高。與I/R組比較，橙皮苷組SOD活性顯著升高且MDA含量降低(t=-11.062、7.974，P均<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠心肌組織SOD及MDA的變化

注：與假手術組比較，aP<0.05；與I/R 組比較，bP<0.05

2.3 心肌組織LC3II及Beclin1 與假手術組大鼠心肌組織Beclin1(0.108±0.026)及LC3II(0.136±0.013)的表達水平比較，I/R組大鼠心肌組織Beclin1(0.518±0.050)及LC3II(0.517±0.062)的表達水平顯著增高(t=-18.919、-14.560，P均<0.05)，提示再灌注后缺血心肌自噬增強。與I/R組比較，橙皮苷組大鼠心肌組織Beclin1(0.198±0.019)及LC3II(0.234±0.034)的表達水平明顯低于I/R組(t=17.489、10.815，P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織Beclin1及LC3II的表達變化

2.4 心肌組織LC3II表達 假手術組大鼠心肌組織LC3II的表達極少，幾乎不可見；I/R組大鼠心肌組織可見大量的LC3II表達，提示缺血/再灌注后心肌自噬被顯著激活。而橙皮苷組大鼠心肌組織LC3II的表達明顯低于I/R組。圖2見封3。

3 討 論

正常情況下，自噬在心肌細胞中處于低水平狀態，起著維持細胞穩態的作用。而在心肌缺血/再灌注損傷中，隨著缺血、低氧時間的延長，自噬在心肌缺血期被激活，此時自噬可降解心肌細胞中無重要功能物質，給缺血缺氧心肌提供營養物質，對心肌細胞起著保護作用；而再灌注期間，自噬進一步增強，過度的自噬可降解心肌細胞中關鍵成分，引發心肌細胞結構及功能障礙，促進心肌細胞死亡[5]。故自噬在心肌缺血/再灌注損傷中有著重要的作用。Beclin1是自噬體形成過程中不可或缺成分，而LC3則直接參與自噬體的形成[13]，Beclin1和LC3的表達越多則表明自噬越強。在本實驗中，與假手術組相比，I/R組大鼠心肌組織自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表達顯著增加，且這種變化在心肌組織LC3B熒光染色中得到進一步證實，提示再灌注后心肌組織的自噬顯著增強。同時，I/R組大鼠血清心肌酶CK及LDH的水平也顯著高于假手術組，提示缺血再灌注后過度自噬可加重心肌細胞損傷，表明自噬在再灌注期間起著心肌損傷作用。

橙皮苷是一種在橘柑類水果中含量豐富的黃烷酮類化合物，近年來因其多樣的生物活性引起了許多研究者的關注。Huang等[14]報道了在β樣淀粉蛋白誘導的神經細胞糖代謝損傷模型中，橙皮苷可下調自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表達，抑制自噬的激活，改善神經細胞糖代謝損傷，促進神經細胞的存活。而Saiprasad等[15]研究表明橙皮苷可上調自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表達，觸發結腸腫瘤細胞自噬，抑制氧化偶氮甲烷誘導的結腸惡性腫瘤的發生。在本實驗模型中，與I/R組相比，橙皮苷組大鼠心肌組織LC3Ⅱ和Beclin1的表達顯著下降，且血清CK和LDH的水平也顯著降低，表明橙皮苷可能通過抑制心肌細胞自噬，進而減輕心肌缺血/再灌注損傷。

心肌缺血/再灌注期間誘發自噬的因素很多，包括低氧、缺血、ATP耗竭、內質網應激及氧化應激等[16]。Hariharan等[17]報道了在心肌細胞缺氧/復氧模型中，過氧化氫所致氧化應激損傷可顯著升高自噬蛋白LC3的表達，而巰丙酰甘氨酸(一種抗氧化劑)可顯著減輕氧化應激的同時降低LC3的表達，表明氧化應激可激活自噬，且減輕氧化應激可抑制自噬。SOD作為胞內抗氧化系統的主要抗氧化酶之一可體現細胞抗氧化的能力，其活性越高則細胞抗氧化能力越高；而MDA作為脂質過氧化反應的主要代謝產物反映了脂質過氧化反應的嚴重程度，其含量越多則脂質過氧化反應越重；兩者皆可作為氧化應激的指標。在本實驗中，與假手術組相比，I/R組大鼠心肌組織的抗氧化酶SOD活性顯著降低且脂質過氧化指標MDA顯著升高，提示再灌注后心肌組織氧化應激嚴重；且同時伴隨著自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的增加，提示心肌缺血/再灌注后，氧化應激誘發自噬的過度激活，與上述文獻結果一致。Gandhi等[9]報道了橙皮苷在心肌缺血/再灌注模型中可顯著減輕氧化應激，提示橙皮苷具有較強的抗氧化活性。在本實驗中，橙皮苷組大鼠心肌組織SOD的活性顯著增高，MDA的含量明顯降低，同時LC3Ⅱ和Beclin1的表達也顯著降低，提示橙皮苷可能通過抑制氧化應激，進而抑制過度自噬的發生，從而減輕心肌缺血/再灌注損傷。

綜上所述，橙皮苷可抑制心肌缺血/再灌注損傷誘導的心肌細胞自噬，進而減輕心肌缺血/再灌注損傷，其機制與橙皮苷減輕氧化應激有關[17～19]。但本研究只觀察了橙皮苷對再灌注時期自噬的影響，而橙皮苷對單純缺血期自噬的作用尚未關注。另外，橙皮苷抑制心肌缺血/再灌注損傷所誘導自噬的具體分子機制也仍待進一步研究。

1 Yellon DM,Hausenloy DJ.Myocardial reperfusion injury[J].N Engl J Med,2007,357(11):1121-1135.

2 Levine B,Klionsky DJ.Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy[J].Dev Cell,2004,6(4):463-477.

3 Hamacher-Brady A,Brady NR,Logue SE,et al.Response to myocardial ischemia/reperfusion injury involves Bnip3 and autophagy[J].Cell Death Differ,2007,14(1):146-157.

4 Thapalia Ba ZZ,Lin X.Autophagy,a process within reperfusion injury:an update[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(12):8322-8341.

5 Ma S,Wang YB,Chen YD,et al.The role of the autophagy in myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease,2015,1852(2, SI):271-276.

6 Saiprasad G,Chitra P,Manikandan R,et al.Hesperidin alleviates oxidative stress and downregulates the expressions of proliferative and inflammatory markers in azoxymethane-induced experimental colon carcinogenesis in mice[J].Inflamm Res,2013,62(4):425-440.

7 Abuelsaad AS, Allam G,Al-Solumani AA. Hesperidin inhibits inflammatory response induced by Aeromonas hydrophila infection and alters CD4+/CD8+ T cell ratio[J]. Mediators Inflamm,2014:393217.

8 Kalpana KB,Devipriya N,Srinivasan M,et al.Evaluating the radioprotective effect of hesperidin in the liver of Swiss albino mice[J].Eur J Pharmacol,2011,658(2/3):206-212.

9 Gandhi C.Upaganalawar a and balaraman R.protection against in vivo focal myocardial ischemia/reperfusion injury-induced arrhythmias and apoptosis by hesperidin[J].Free Radic Res,2009,43(9):817-827.

10 陸紅玲,韓連奎,劉達興,等.橙皮苷對缺血再灌注損傷模型大鼠心肌組織保護作用的研究[J].中國藥房,2012,23(3):203-205.11 Rong Z,Pan R,Xu Y,et al.Hesperidin pretreatment protects hypoxia-ischemic brain injury in neonatal rat[J].Neuroscience,2013,255:292-299.12 Agrawal YO, Sharma PK, Shrivastava B, et al. Hesperidin blunts streptozotocin-isoproternol induced myocardial toxicity in rats by altering of PPAR-gamma receptor.[J] Chem Biol Interact,2014,219:211-220.

13 Zhang YL,Yao YT,Fang NX,et al.Restoration of autophagic flux in myocardial tissues is required for cardioprotection of sevoflurane postconditioning in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2014,35(6):758-769.

14 Huang SM,Tsai SY,Lin JA,et al.Cytoprotective effects of hesperetin and hesperidin against amyloid beta-induced impairment of glucose transport through downregulation of neuronal autophagy[J].Mol Nutr Food Res,2012,56(4):601-609.

15 Saiprasad G,Chitra P,Manikandan RA.Hesperidin induces apoptosis and triggers autophagic markers through inhibition of Aurora-A mediated phosphoinositide-3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase-3 beta signalling cascades in experimental colon carcinogenesis[J].Eur J Cancer,2014,50(14):2489-2507.

16 Kiffin R.Bandyopadhyay U,Cuervo AM.oxidative stress and autophagy[J].Antioxid Redox Signal,2006,8(1/2):152-162.

17 Hariharan N, Zhai P,Sadoshima J. Oxidative Stress Stimulates Autophagic Flux During Ischemia/Reperfusion[J].Antioxid redox sign,2011,14:2179-2190.

18 朱小琴,華曉芳,李磊，等.橙皮素抗apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化作用及其機制[J].疑難病雜志,2015,14(2):171-174.

19 胡哲夫,唐其柱,劉源，等.橙皮素對轉化生長因子-β1誘導心肌成纖維細胞增殖的影響[J].疑難病雜志,2015,14(4):376-379.

The effects of hesperidin on myocardial ischemia/reperfusion injury induced by autophagy

LIXuefei,JIANGHong,HUXiaorong,MARuisong.DepartmentofCardiology,RenminHospital,WuhanUniversity,HubeiProvince,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:JIANGHong,E-mail:jianghwurm@163.com

Objective To investigate the effect of hesperidin on myocardial ischemia/reperfusion injury of myocardial cells induced by autophagy and its possible mechanism.Methods 24 male SD rats were randomly divided into sham operation group, ischemia / reperfusion (I/R) group and hesperidin group with 8 rats in each group. Sham operation group were treated with 0.5% carboxymethylcellulose sodium orally, after 3 days, thoracotomy were performed to expose the left anterior descending coronary artery (LAD) but not ligation, in I/R group and hesperidin group were blocking LAD’s flow for 30 min, then with 4 hours of reperfusion to establish the rat myocardial ischemia / reperfusion injury model. After the operation, detected the serum creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) and autophagy protein, microtubule associated protein 1 light chain 3 II (LC3 II) and Beclin1 level in the myocardial tissue. Results Compared to sham operation group, I/R group rats’ serum CK and LDH levels were significantly increased, SOD activity of myocardial tissue were significantly decreased, MDA content significantly increased (P<0.05), compared with I/R group, hesperidin group’s serum CK and LDH levels significantly decreased, SOD activity of myocardial tissue was significantly increased, MDA content decreased significantly (P<0.05). Compared with the sham group, I/R group rats’ myocardial tissue LC3 II and Beclin1 levels increased significantly, compared with I/R group, hesperidin group’s index expression levels were significantly lower (P<0.05).Conclusion Hesperidin can inhibit myocardial ischemia / reperfusion injury induced cardiomyocyte autophagy, and the mechanism is related with hesperidin reduce the oxidative stress.

Hesperidin; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Autophagy; Oxidative stress; Rats

430060 武漢大學人民醫院心血管內科

江洪，E-mail:jianghwurm@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.024

2015-05-30)