泰山螭霖魚全人工催產繁殖技術初步研究

林貞賢，甘慶萌，張聰

(泰山學院生物與釀酒工程學院，山東泰安271000)

泰山螭霖魚全人工催產繁殖技術初步研究

林貞賢，甘慶萌，張聰

(泰山學院生物與釀酒工程學院，山東泰安271000)

本研究以不同種類及劑量的催產藥物對泰山螭霖魚進行注射催產，并測定了催產前后親魚體內GtH水平的變化.結果表明:以人體絨毛膜促性腺激素(HCG)25IU+促黃體釋放激素類似物A2(LHRHA2)0.4μg+地歐酮(DOM)0.2mg的催產組效果最佳，其效應時間12h左右，催產率為66.7%，且與對照組差異顯著，后經人工擠卵、授精，并成功孵化出了仔魚;催產效果與催產時機(親魚的性腺成熟度)相關;催產藥物可提高雌雄親魚體內促性腺激素(GtH)的水平.

泰山螭霖魚;人工催產;促性腺激素(GtH)

泰山螭霖魚(Varicorhinus°macrolepis Bleeker)學名多鱗白甲魚，俗稱赤鱗魚，隸屬鯉科、鲃亞科、白甲魚屬，是一種為泰山所獨有的小型野生魚類，是泰安市首個獲得國家地理標志保護的產品，其人工開發利用前景廣闊［1－2］.

目前，經泰安市水產養殖專家多年的努力，泰山螭霖魚的人工繁殖已取得成功，主要包括親魚培育、組群、制造人工產盆、收卵、孵化等環節［3］.整套繁殖技術相對原始落后，加之螭霖魚屬分批產卵的類型，自然狀態下無法實現集約化、規模化育苗.人工催產可以使雌魚集中產卵，便于受精卵的孵化與仔魚的培育.現如今，許多之前繁殖困難的商品魚，如黃顙魚［4］，泥鰍［5］等都實現了人工催產和規模化繁殖.然而，目前，螭霖魚在人工催產方面還沒有一套成熟的技術，雖然有劉傳忠［6］、劉永進［7］、朱桂玉［8］等人先后對泰山螭霖魚的人工催產技術進行了初步研究，但其催產效果仍待進一步驗證和優化，全人工繁殖技術更是尚未見報道.本項目組成員于2015年4月至5月對螭霖魚進行了人工催產、擠卵、授精、孵化等繁殖技術的初步研究，并測定了注射催產激素前后雌雄親魚體內促性腺激素(GtH)的水平，本研究的開展旨在為螭霖魚規模化、集約化苗種繁育提供理論和技術支持.

1 材料與方法

1.1 親魚培育

選擇體質健壯、性情活潑、無病、無傷的4冬齡螭霖魚(雌雄各半，雌魚體重50g左右，雄魚體重35g左右)作為親魚，6－12尾親魚投放在循環水族箱(100×80×40cm)中進行強化培育，整個繁殖期間水族箱水溫控制在18－21℃.親魚每天投喂升索牌漁用飼料(S8)2次，投喂量為其體重的0.5%－1%.每天對水族箱中的水質、水溫及親魚的吃食情況進行觀察記錄，并對水族箱進行吸污和換水，換水量為總水體的1/5左右.

1.2 人工催產

在四月下旬時，我們觀察到雄魚對雌魚追逐增強并不時撞擊雌魚腹部，撈起雄魚并輕擠腹部即有濃稠且呈乳白色的精液流出，入水即散.雌魚腹部膨大柔軟，卵巢輪廓明顯.我們于4月22日，隨機選取雌魚20尾進行了第一次批次的催產實驗，催產藥物為HCG 60IU/尾.第二批次于5月1日進行，隨機選取雌魚12尾，分成四個繁殖組，每組均為雌魚3尾，各組劑量分別為HCG50 IU/尾、HCG40IU/尾、HCG60 IU/尾和HCG75IU/尾.于5月9日進行第三批次實驗，隨機選取雌魚15尾，分成三個繁殖組，第各組催產劑種類和劑量分別為HCG50IU/尾、LHRH－A20.5μg+DOM0.2mg/尾、HCG50IU+LHRH－A20.5μg +DOM0.2mg/尾.于5月13日進行了第四批次催產:精選成熟度高的雌魚6尾，催產劑種類和劑量為HCG25IU+LHRH－A20.4μg+DOM0.2mg/尾.四個批次均設置對照組(雌魚10尾).注射催產藥物劑量在0.15ml－0.25ml，所用絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素類似物A2(LHRH－A2)和地歐酮(DOM)，均為寧波市三生藥業有限公司出品.

注射和尾靜脈采血均使用lmL注射器配5.5號靜脈輸液針.注射方法為:將親魚撈出并用干凈的紗布裹住，一人固定魚的頭部與尾部，一人手持針頭在胸鰭基部無鱗處的凹入部位，將針頭朝魚體前方與體表成45°角刺入約1cm，后將注射液緩緩注入魚體內.

1.3 人工授精

催產注射12h后，對實驗中的處理組和對照組均嘗試進行人工擠卵.催產組若有飽滿游離的卵粒流出，則計為催產成功，若沒有卵子流出，則親魚放回繼續培育，12h經2次嘗試擠卵，仍無卵粒流出，則為催產失敗.人工擠卵的具體操作如下:撈取雌魚，用干爽的紗布將魚身包住，擦干其腹部及泄殖孔，使魚尾斜向下，一手固定魚的頭部，一手輕輕地由上而下擠壓雌魚腹部，若有魚卵流出，則落入潔凈干燥的搪瓷托盤中.擠出魚卵后立即撈取一尾雄魚，用同樣的方法，將精液擠壓至魚卵上，為保險起見，再撈一尾雄魚，將精液擠入魚卵上.用毛筆將精卵充分混勻，再倒入適量的精子稀釋液(0.2%的生理鹽水)，并用毛筆輕輕攪動精卵，使之充分混合，然后加入晾曬過的自來水，輕輕攪拌，倒掉一部分水，再加入新水，如此反復多次，盡快地沖洗掉多余的精液，同時，盡量使所有的卵粒都散開，觀察到卵膜吸水膨脹后，加水深約1cm，受精卵在盤中靜水孵化.

1.4 人工孵化

靜水孵化是在室內進行，并用硬紙板對孵化盤進行遮光處理，孵化水溫在18－20℃，孵化過程中每8個小時換水一次，每次換去托盤中2/3的水，緩緩加入新水，避免水流過大沖擊受精卵.換水時挑去發白的魚卵，當鏡檢發現受精卵處于囊胚后期或原腸胚前期，統計受精率.3天左右魚卵孵化出膜，統計出苗數，之后每次換水挑去發育過程中的死胚，8天左右，健康的仔魚能正常平游，統計出苗數.

1.5 激素測定

為了比較泰山螭霖魚催產前后體內促性腺激素(GtH)的水平變化，本研究于5月16日和29日先后進行了兩次測定.具體方法為:每次均對雌雄各6尾親魚進行注射催產，劑量為HCG25IU+LHRHA20.4μg+DOM0.2mg/尾(催產組)，0.6%生理鹽水0.15ml(陰性實驗對照組)在催產前和注射催產激素12h后分別隨機抽取雌雄泰山螭霖親魚各3尾，進行尾靜脈采血(1mL/尾)，所抽取血液均加入離心管并做好標記，室溫放置2h，1000 rpm/min離心20 min，取上清，用魚類促性腺激素釋放激素ELISA試劑盒(南京森貝伽公司所生產)，測定樣品中魚促性腺激素(GtH)的含量.

1.6 數據統計與分析

用SPSS 22.0統計軟件包中的fisher精確概率法對催產組和對照組進行卡方檢驗，P＜0.05為差異顯著.

2 結果

2.1 催產效果

各批次親魚，經2次嘗試擠卵，其中第4批次催產率最高，為66.7%，第1批次催產率為25%，第2、3批次均不理想，分別有2個和1個催產組在注射催產藥物后，未表現出應有的效應.各批次的受精率較高，魚卵破膜率也較高，而出苗率很低，詳見表1.

表1 螭霖魚催產及受精卵孵化情況

本次實驗中，第一批次產卵5尾，未產15尾.第二批次中第1、2催產組均為產卵1尾，未產2尾.第三批次第1、2催產組均為產卵1尾，未產4尾.第四批次產卵4尾，未產2尾，詳細結果見表2.卡方檢驗結果顯示前三批次中催產組與對照組之間的差異不顯著(P＞0.05)，第四批次中催產組與對照組之間差異顯著(P＜0.05).結果見表2.

表2 人工催產組與對照組情況對比

2.2 注射催產激素對螭霖魚促性腺激素(GtH)的影響

5月16日和29日兩次注射催產激素后，均發現雄魚有不斷追逐雌魚現象，放入產卵沙盆12h后未實現其自然產卵.通過測定促性腺激素(GtH)發現，5月16日催產組前后雄魚體內GtH含量平均為475ng/L和570ng/L，催產前后雌魚體內GtH含量平均為210ng/L和380ng/L.5月29日催產前后雄魚體內GtH含量平均為385ng/L和505ng/L，雌魚體內GtH含量平均為192ng/L和267.5ng/L，而注射生理鹽水的對照組內雌雄魚體內激素變化不大，結果詳見表3.

表3 激素對螭霖魚體內促性腺激素(GtH)的影響

3 分析與討論

魚類繁殖是在下丘腦—腦垂體—性腺軸的控制下完成的.利用外源激素處理是控制養殖魚類繁殖成熟的重要可靠方法.最常用魚類催產劑有絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素(LHRHA)、魚類腦垂體(PG)等，外源激素可刺激腦垂體釋放促性腺激素(GtH)，誘導卵巢性腺類固醇激素的生成和卵子的排放.

HCG是從妊娠早期的孕婦或孕畜尿中提取出來的一種糖蛋白激素，可直接作用于性腺，具有誘導排卵的作用.劉永進等人通過對泰山螭霖魚親魚注射1IU/g的HCG進行人工催產，取得了較好效果［7］.但我們三個批次的HCG單劑注射催產實驗，催產效果均不理想(催產率25%－33%).造成這種差異的原因是HCG的選擇與性腺發育程度密切相關，劉永進［7］等人催產日期為5月22日，晚于我們的催產日期，分析可能他們所用的親魚成熟程度好，正符合了HCG所具有較強促排卵的作用，但催熟機制不及垂體和釋放激素類似物的特點.筆者認為單用HCG催產螭霖魚時，效果不佳.尤其是在螭霖魚繁殖初期，即使增加用量到1.2IU/g和1.5IU/g，催產效果仍不明顯.我們在隨后的人工擠卵時發現有個別雌魚腹部膨大、變硬，生殖孔紅腫，輕壓腹部有渾濁并微帶有黃色液體流出，這可能是高劑量的HCG使魚卵快速吸水膨脹，無法產出體外，而在體內退化所致.

LHRH－A是一種人工合成的九肽激素，相對分子質量小，反復使用不會產生抗藥性，并對溫度的變化敏感性較低.地歐酮(DOM)是一種多巴胺抑制劑，可以抑制或消除促性腺激素釋放激素抑制激素(GRIH)對下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的影響，從而增加腦垂體GtH的分泌，促使性腺發育成熟.Linpe方法(即LHRH－A加多巴胺D2受體拮抗劑地歐酮)廣泛用于鰱、鳙、草、青魚的人工催產［9］.本研究中第三批次第三催產組利用這兩種催產劑對螭霖魚進行催產，兩次嘗試擠卵均未成功，分析可能與親魚性腺發育成熟度差、樣本小有關.同泰山螭霖魚同屬鲃亞科的倒刺鲃，采用一次注射催產激素后再采用人工授精的方法，催產成功并獲得產卵率80%的好效果，催產劑種類和劑量為雌魚注射LHRHA24μg+DOM 5mg/kg［10］.因此，LHRH－A2+DOM對螭霖魚的催產效果仍需進一步驗證.

目前，魚類催產中多用這三種激素互相混合使用，注射劑量受親魚性腺發育成熟度、水溫、雌雄比等因素影響.我們第三批次混合這三種催產劑對螭霖魚進行催產，效果仍然不理想.劉傳忠［6］等人給每尾雌魚(93g)注射劑量為HCG150UI+LHRH－A23μg，但注射催產藥物后，螭霖魚親魚未表現出應有效應.這與本研究第三批次出現的現象較一致，這可能與HCG注射劑量偏大、1次注射、注射時機不適等因素有關.大劑量催產藥物的使用以及時機過早可能是我們催產失敗的原因.

在最適宜的時機對親魚進行催產，是家魚人工繁殖取得成功的關鍵因素之一［9］.我們在進行第四批次的催產實驗時，挑選了腹部膨大、柔軟有彈性，生殖孔紅潤的雌魚作為催產組，采用和第三批次的實驗組近似的注射劑量，取得了不錯的催產效果，催產率達到了66.7%，催產組與對照組相比差異顯著.這可能與本批次催產時機合適有關.目前，催產時機都是以雌魚腹部柔軟膨大、生殖孔紅腫等主觀判斷，影響因素較多，增加了生產上的難度.

本研究中有個明顯的特點就是首次對泰山螭霖魚進行全人工繁殖試驗，這在螭霖魚人工繁殖研究中還是首次.經過人工注射催產、人工擠卵、人工授精、人工孵化等階段，成功孵化出1000余尾仔魚.本研究中受精率高(72%－95%)，魚卵破膜時間較短(＜3d)，破膜率較高(50%－82%)，但破膜仔魚畸形較多，如歪尾、曲背、卵黃囊腫大等，畸形仔魚絕大多數均陸續夭折，導致整體出苗率很低(10%左右).造成這種現象的原因有兩點:一是人工擠卵最佳時機較難掌握，擠出的卵子有時不夠成熟或過熟，即使精卵能受精，胚胎的畸形率和死亡率也較高，進而影響出苗率.二是螭霖魚胚后期很長，從破膜到仔魚平游仍需7－8天.而出膜后，雖屬胚后階段，但剛出膜的仔魚發育很不完善，無胸鰭保持平衡，無鰾不能上下沉浮，眼睛無色素不能感光，腸道未通，不能攝食.它全身裸露在水中，做拋石式扭動，對溶氧需求驟然增加，它們對不良環境的適應能力最差，導致本研究中出苗率低.所以，螭霖魚苗破膜后采用何種孵化方式培育就顯得尤為重要.

本研究結果表明，催產激素的注射可提高雌雄親魚體內促性腺激素(GtH)的水平.GtH的分泌受到下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素(GnRH)和多巴胺的雙重調節，排卵和產卵也是以血清GtH的急劇升高為先導的，而最終能否排卵還有賴于血清GtH峰是否超過“排卵閾值”［11］.盡管注射催產激素后的螭霖魚雌魚血清GtH水平也有大幅提高，但仍低于雌魚，也沒有實現自然產卵，可能因為雌魚血清GtH峰未達到“排卵閾值”.對螭霖魚來說，繁殖困難在于雌魚性腺發育成熟并成功產卵，因為雄魚性腺發育成熟早且持續時間長，這種情況在硬骨魚類中具有一定的普遍性.盡管第五、六批次注射激素并未實現螭霖魚的自然繁殖，但這與注射時間過晚，雌雄魚性腺均已退化有關.本研究說明適量的催產劑及催產時機可實現螭霖魚的全人工催產繁殖.

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A Preliminary Study on the Technology of Artificial Reproduction of Varicorhinus Macrolepis

LIN Zhen－xian，GAN Qing－meng，ZHANG Cong
(School of Biology and Brewing Engineering，Taishan University，Tai＇an，271000，China)

The aim of the present study is to find the controlling factors of the artificial inducement reproduction of varicorhinusmacrolepis.Different types and doses of oxytocin were injected into the parents of varicorhinusmacrolepis for artificial inducement reproduction，and concentrations of gonadotropin(GtH)in male and female parent fish were measured before and after the injection of oxytocin.Results showed that the highest spawning rate group was which was injected with 25IU Human Chorionic Gonadotropin(HCG)+0.4μg Luteinizing Hormone Releasing Hormone－A2(LHRH－A2)+0.2mg Domperidone(DOM)，and the spawning rate reached 66.7%，which was significantly higher than the control group.After waiting for about 12 hours，eggs were squeezed and inseminated artificially，and then the fry was hatched successfully.Secondly，the effect of oxytocin was associated with the development level of the parent fish.Finally，the injection of oxytocin could improve the level of gonadotropin(GtH)in male and female parent fish.

varicorhinusmacrolepis;artificial inducement reproduction;gonadotropin(GtH)

S961.2

A

1672－2590(2015)06－0094－05

2015－10－11

國家級大學生創新創業訓練計劃項目(201410453011)

林貞賢(1979－)，男，山東新泰人，泰山學院生物與釀酒工程學院講師.