超高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法測定參松養心膠囊中人參皂苷Rg1和Re含量

陳小娟，李志紅，劉 靜，劉 賀

(北京以嶺藥業有限公司，北京 102600)

參松養心膠囊由人參、麥冬、山茱萸、丹參、赤芍、黃連等12味中藥組方，具有益氣養陰、活血通絡、清心安神功效。處方中以人參為君藥，其皂苷類成分為主要有效成分[1]。現行質量標準中人參皂苷Rg1和Re的含量測定采用高效液相色譜(HPLC)法[2]，但非常耗時，運行時間一般在90 min以上。本研究中應用超高效液相色譜(UPLC)法技術建立了參松養心膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測定方法，現報道如下。

1 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC H－Class system液相色譜儀，包括四元泵處理器、樣品處理器、柱溫箱及Empower3色譜工作站;ACQUITY ELSD蒸發光檢測器。人參皂苷Rg1對照品(批號為110703－201127)，人參皂苷 Re對照品(批號為 110754－201123)，均由中國食品藥品檢定研究院提供;參松養心膠囊(北京以嶺藥業有限公司);乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm);流動相:乙腈 －水，梯度洗脫(見表 1);流速:0.45mL/min;柱溫:35℃;進樣量:2 μL;ACQUITY ELSD檢測器條件:漂移管溫度為50℃，氣體流量為30.0 psi。理論板數按人參皂苷Re峰計算應不低于20 000。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液制備

取本品30粒的內容物，精密稱定，混勻，研細，取約4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率160 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液50 mL，蒸干，殘渣加水30 mL溶解，用三氯甲烷振搖提取3次(30，20，20 mL)，棄去三氯甲烷液，水溶液用水飽和的正丁醇振搖提取5次(25，25，25，15，15 mL)，合并正丁醇液，用氨試液洗滌 2 次(30，20 mL)，分取正丁醇液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次(30，20 mL)，合并氨洗液和水洗液，用水飽和的正丁醇振搖提取3次(20，20，15 mL)，合并正丁醇提取液，并與上述正丁醇液合并，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。取人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL各含0.2mg的混合溶液，搖勻，作為對照品溶液。按處方工藝比例，自配不含人參的群藥，按工藝要求制成不含人參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

圖1 超高效液相色譜圖

2.3 方法學考察

空白干擾試驗和系統適用性試驗:精密吸取2.2項下3種溶液各2 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定。結果，陰性對照品溶液色譜中，在與人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對照品相同保留時間處未見相應色譜峰，故認為陰性無干擾。同時，人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的分離度為2.5，理論板數以人參皂苷Rg1和人參皂苷Re計分別為97 988和100 711，滿足系統適用性要求。色譜圖見圖1。

線性關系考察:取人參皂苷Rg1和人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.455 4 mg人參皂苷Rg1和0.415 3 mg人參皂苷Re的對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液 0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL，按擬訂色譜條件依法進樣測定。以色譜峰峰面積對數值(Y)為縱坐標、進樣量對數值(X)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程，人參皂苷Rg1為 Y=0.368 X+3.755 4，r=0.999 1(n=6)，進 樣 量 在 0.091 08 ～1.135 8 μg范圍內與峰面積線性關系良好;人參皂苷Re為 Y=0.372 X+3.812 1，r=0.999 2(n=6)，進 樣 量 在 0.083 06 ～1.038 25 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液(含人參皂苷Rg1 0.227 7 g/L，人參皂苷 Re 0.207 6 g/L)2 μL，連續進樣 6 次。結果峰面積的 RSD人參皂苷Rg1為0.91%(n=6)，人參皂苷Re為0.73%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別于 0，1，2，4，8，16，24 h時進樣2 μL，計算峰面積的 RSD值。結果的 RSD人參皂苷Rg1為 1.03%(n=7)，人參皂苷 Re 為 0.82%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內穩定。

重復性試驗:取同一批號(批號為1308030)的樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果含量的 RSD人參皂苷 Rg1為 1.06%(n=6)，人參皂苷 Re 為 0.88%(n=6)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為1308030)6份，每份2 g，精密稱定，分別精密加入每1 mL含0.455 4 mg人參皂苷Rg1和0.415 3 mg人參皂苷 Re的對照品貯備液各2mL，按2.2項下供試品溶液制備方法制備溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表2。樣測定，按外標兩點法對數方程計算供試品中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總量。結果見表3。

3 討論

2.4 樣品含量測定

分別精密稱取10批樣品，每批2份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再分別按擬訂色譜條件依照UPLC法和HPLC法[2]進

UPLC法是以1.7 μm的超細色譜柱填料為核心的新興色譜分離技術[3]，改變的僅是色譜柱的粒徑大小，并未改變方法的分離原理[4]。本研究主要通過轉換流速、進樣量和流動相梯度條件:HPLC上1 mL/min流速轉換到UPLC上為0.45 mL/min;HPLC上15 μL的進樣量在UPLC上為2 μL;流動相梯度在HPLC[2]基礎上進行了調整，使在HPLC上90 min完成的分析在UPLC上用16 min即可完成。

UPLC法分離度、峰容量、分析速度、靈敏度和分辨率均較HPLC法有很大提高，與傳統的HPLC法相比，UPLC法的分析速度、靈敏度及分離度分別是HPLC法的9倍、3倍及2倍;在相同色譜條件下，UPLC法能分出更多的色譜峰[5]。HPLC法同時測定人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量一般需1 h以上時間，樣品組分才能得到較好地分離。本研究所建立的UPLC法僅需16 min即可完成參松養心膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測定，分析速度提高了5倍以上，大大減少了溶劑損耗和廢液處置費用，減少了環境污染，降低了分析成本。同時，該方法可用于參松養心膠囊人參提取物及中間產品中人參皂苷Rg1和Re含量檢測的內控，以縮短檢驗周期，減少物料庫存和中間產品的積壓，提高生產效率，起到節能降耗的作用。

表2 加樣回收試驗結果(n=6)

表3 樣品含量測定結果(mg/g)

本研究中還考察了將HPLC用大顆粒色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)直接連接到 UPLC 上，按照 HPLC 法測定條件[2]進行測定。結果表明，HPLC法的測定條件可直接用于UPLC上，測定結果與HPLC法測定結果一致。

[4]，本研究中還曾采用紫外檢測器取代蒸發光檢測器進行了含量測定摸索試驗。檢測波長為203 nm，梯度洗脫條件略有改動，其他條件均采用本研究中建立的UPLC－ELSD方法。結果人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的分離度為2.2，理論板數以人參皂苷Rg1和人參皂苷Re計分別為276 215和381 460。可見，UPLC－UV法也可用于參松養心膠囊中人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的含量測定。但由于參松養心膠囊質量標準為《中國藥典》[2]法定標準，同時，不同檢測器檢測信號存在差異，為了盡可能地減少企業內控標準與法定標準的差異，本研究未將參松養心膠囊人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的UPLC－UV含量測定方法納入企業內控標準，也未進行更深入的方法學研究。

參考文獻:

[1]莫炫永.HPLC測定參松養心膠囊中人參皂苷Rb1的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(12):112－114.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版·第二增補本[M].北京:中國醫藥科技出版社，2013:51－53.

[3]謝耀軒，林亞珠.超高效液相色譜法測定三七中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[J].廣東藥學院學報，2011，27(5):489－493.

[4]楊立偉，鄭傳奇，蔣忠軍，等.超高效液相色譜法測定西洋參中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量[J].中藥材，2008，31(1):55 － 57.

[5]顏 梅，李詒光，趙 明，等.超高效液相色譜在中藥含量測定中的運用[J].亞太傳統醫藥，2011，7(11):176－178.